商品化試劑盒檢測(cè)方法有很多，且每一種檢測(cè)方法的使用范圍和方法提要，以及所用到的檢測(cè)儀器設(shè)備都一致，當(dāng)然其效果也有很大差異，對(duì)此儀多多就將乳酸鏈球菌素的商品化試劑盒檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范展示如下，可供參考！

1、范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中乳酸鏈球菌素的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于檢測(cè)含乳飲品及肉制品等食品中乳酸鏈球菌素 A 及乳酸鏈球菌素 Z 的含量。

2、規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其較新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法；SN/T 2775 商品化食品檢測(cè)試劑盒評(píng)價(jià)方法。

3、術(shù)語(yǔ)和定義 下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1乳酸鏈球菌素 nisin

乳酸乳球菌發(fā)酵后提取而制得的食品添加劑乳酸鏈球菌素，是一種多肽物質(zhì)，由 34 個(gè)氨基酸殘基組成。用于食品添加劑的有 Nisin A 和 Nisin Z 兩種類型：Nisin A 的分子式為 C140H230O37N42S7，相 對(duì)分子量為 3 354.35 Da ；Nisin Z 的分子式為 C140H230O37N42S7，相對(duì)分子量為 3 330.31 Da。兩種類型的乳酸鏈球菌素分子結(jié)構(gòu)在第 27 位的氨基酸不同，Nisin A 第 27 位氨基酸為組氨酸，Nisin Z 第 27 位氨基酸為天冬酰胺。

4、方法提要

樣品中的乳酸鏈球菌素和試劑盒中微孔條上預(yù)包被的抗原競(jìng)爭(zhēng)乳酸鏈球菌素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用底物顯色液顯色，樣本吸光值與所含乳酸鏈球菌素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中乳酸鏈球菌素的含量。

5、材料和試劑

除另外說(shuō)明外，所有試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水。

5.1 乳酸鏈球菌素檢測(cè)試劑盒。試劑盒評(píng)價(jià)參見(jiàn) SN/T 2775，具體評(píng)價(jià)結(jié)果參見(jiàn)附錄 A。試劑盒組成 如下：（a） 96 孔酶標(biāo)板：12 條 ×8 孔（包被偶聯(lián)抗原）；

SN/T 5216—2020 （b） 乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品：0 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、2.5 mg/L、12.5 mg/L、62.5 mg/L；（c）高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：100 mg/L；（d）酶標(biāo)記物濃縮液；（e）抗體工作液；（f）濃縮清洗液；（g）樣品提取液；（h） 顯色液：底物 A、底物 B；（i）終止液。 試劑盒應(yīng)在 4 ℃～8 ℃避光條件下保存，溶解后的酶標(biāo)記物應(yīng)在 -15 ℃條件下凍存。

5.2 鹽酸。

5.3 氫氧化鈉。

5.4 正己烷。

6、儀器

6.1 天平：量程 100 g, 感量 0.01 g； 6.2 酶標(biāo)儀：波長(zhǎng) 450 nm；6.3 渦旋儀；6.4 離心機(jī)；6.5 混合振蕩器；6.6 單道移液器：20 μL～200 μL、100 μL～1 000 μL、500 μL～5 000 μL；6.7 多道移液器：30 μL～300 μL；6.8

聚苯乙烯離心管：2 mL、10 mL、50 mL；6.9 研缽或粉碎裝置；

7、試樣的制備和提取

7.1 牛奶、飲料類液體樣品：用樣品提取液將樣本稀釋 10 倍，取 50 μL 用于分析。樣品稀釋倍數(shù)為 10。

7.2 乳制品、肉制品類固體樣品：稱取 25 g（精確到 0.01 g）樣品，用研缽或粉碎裝置將樣品制成粉末狀或直徑小于 0.3 mm 的顆粒狀，稱取 1 g（精確到 0.01 g）粉末狀制備好的樣品至 50 mL 離心管里，加入 5 mL 樣品提取液，旋渦振蕩混勻 5 min，3 000 r/min 離心 5 min 后靜置 10 min，提取上清 1 mL 至離心管里 ( 注意不要吸到表層的油脂和底層的沉淀 )，取 50 μL 用于分析。樣品稀釋倍數(shù)為 5。

8、分析步驟

8.1 操作條件

所有操作應(yīng)在室溫下（20 ℃～25 ℃）進(jìn)行，乳酸鏈球菌素試劑盒中所有試劑的溫度均應(yīng)回升至室溫后方可使用。

8.2 洗板條件

8.2.1

人工洗滌次數(shù) 4 次，每次注入洗滌工作液 250 μL/ 孔。

8.2.2

自動(dòng)洗板預(yù)定 4 次。

8.3 酶標(biāo)儀測(cè)定條件

SN/T 5216—2020

酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為 450 nm。

8.4 測(cè)定步驟

8.4.1

將測(cè)定需用的微孔板條插入微孔架上，標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)液和樣品等在微孔架上的位置。

8.4.2

吸取50 μL乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（濃度分別為：0 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、2.5 mg/L、12.5 mg/L、62.5 mg/L）和樣品溶液于對(duì)應(yīng)的微孔中。

8.4.3

每孔加入 50 μL 抗體工作液，振蕩混勻，用封孔膜封孔條，置 37 ℃避光環(huán)境中反應(yīng) 30 min。

8.4.4

揭開(kāi)封孔膜，倒掉孔中的溶液，加洗滌工作液，按 8.2 條件進(jìn)行洗板。將微孔架反扣在吸水紙上反復(fù)拍打，除去孔內(nèi)殘留的洗滌工作液。

8.4.5 吸取 100 μL 酶標(biāo)記結(jié)合物溶液到每個(gè)微孔中，振蕩混勻，用封孔膜封孔后置 37 ℃避光環(huán)境中反應(yīng) 30 min，重復(fù) 8.4.4 洗滌微孔。

8.4.6 吸取 100 μL 顯色液到每個(gè)微孔中，振蕩混勻，用封孔膜封孔后置 37 ℃避光環(huán)境中反應(yīng)15 min。

8.4.7 吸取 100 μL 終止液到每個(gè)微孔中，振蕩混勻，將微孔架置于酶標(biāo)儀中，在 450 nm 處測(cè)量吸光度 OD 值。

8.5 平行試驗(yàn)

按以上步驟，對(duì)同一標(biāo)準(zhǔn)溶液、同一樣品溶液均應(yīng)進(jìn)行平行試驗(yàn)測(cè)定。

8.6 空白試驗(yàn)

除不稱取試樣外，用水做空白按 8.4 測(cè)定步驟進(jìn)行。

9 結(jié)果計(jì)算

9.1 讀取 OD 值，按（1）計(jì)算每一標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的百分吸光度值（B）：

百分吸光度值 B=B1/B0×100% ……………………………（1）

式中 ： B1——標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液的平均吸光度值；B0——0 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。

9.2 以標(biāo)準(zhǔn)品百分比吸光度值為縱坐標(biāo)（%），乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，將樣品的百分吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品所對(duì)應(yīng)的乳酸鏈球菌素的濃度后，結(jié)果按式（2）計(jì)算：X=c×V

……………………………（2）式中：X——樣品中乳酸鏈球菌素的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；c—— 從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上得到的樣品中乳酸鏈球菌素濃度，單位為毫克每毫升（mg/L）；V——樣品的稀釋倍數(shù)。也可以用各種酶標(biāo)儀的數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行計(jì)算，所得結(jié)果表示至一位小數(shù)。

9.3 若樣品 B 值高于標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的 B 值范圍，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋后重新測(cè)試SN/T 5216—2020 。

10 、確證試驗(yàn)

如被測(cè)樣品中乳酸鏈球菌素含量大于限量要求，應(yīng)用其他方法進(jìn)行確證。

11 、方法性能指標(biāo)

11.1 檢出限和定量限

檢出限 2.0 mg/kg（mg/L）；定量限 6.0 mg/kg（mg/L）。

11.2 交叉反應(yīng)率

乳酸鏈球菌素 100% ；納他霉素 <0.1% ；苯甲酸鈉 <0.1% ；聚萘氨酸 <0.1% ；山梨酸鉀 <0.1% ； 對(duì)羥基苯甲酸 <0.1% ；多粘菌素 B<1% ；多粘菌素 E<1% ；萬(wàn)古霉素 <1% ；纈氨霉素 <1% ；平陽(yáng)霉素 <1% ；環(huán)孢菌素 A<1%。

11.3 回收率

11.3.1 牛奶、飲料、乳制品（液態(tài)）回收率如下：添加量為 1 μg/mL 時(shí)，回收率為 78.6%～110.6% ；添加量為 30 μg/mL 時(shí)，回收率為 98.7%～117.9% ；

添加量為 300 μg/mL 時(shí)，回收率為 79.4%～116.5%。

11.3.2 肉制品、乳制品（固態(tài)）回收率如下：添加量為 0.5 μg/mL 時(shí)，回收率為 93.1%～105.9% ；添加量為 10 μg/mL 時(shí)，回收率為 75.8%～116.3% ； 添加量為 100 μg/mL 時(shí)，回收率為 88.2%～112.4%。

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