凡應(yīng)用校準(zhǔn)曲線的分析方法，都是在樣品測得信號值后，從校準(zhǔn)曲線上查得其含量(或濃度)。因此，繪制準(zhǔn)確的校準(zhǔn)曲線，直接影響到樣品分析結(jié)果的準(zhǔn)確與否。此外，校準(zhǔn)曲線也確定了方法的測定范圍。
校準(zhǔn)曲線包括標(biāo)準(zhǔn)曲線和工作曲線，前者用標(biāo)準(zhǔn)溶液系列直接測量，沒有經(jīng)過預(yù)處理過程，這對于樣品往往造成較大誤差；而后者所使用的標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)過了與樣品相同的消解、凈化、測量等全過程。
一、如何正確繪制校準(zhǔn)曲線
用一系列被測物標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定的步驟，將被測物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩芤海苽浜玫臉?biāo)準(zhǔn)系列和空白，在方法選定的波長下，測定吸光度。已被測物濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)曲線。
步驟：
1．對標(biāo)準(zhǔn)系列，溶液以純?nèi)軇閰⒈冗M(jìn)行測量后，應(yīng)先作空白校正，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
2．標(biāo)準(zhǔn)溶液一般可直接測定，但如試樣的預(yù)處理較復(fù)雜致使污染或損失不可忽略時，應(yīng)和試樣同樣處理后再測定；
3．校準(zhǔn)曲線的斜率常隨環(huán)境溫度、試劑批號和貯存時間等實(shí)驗條件的改變而變動。因此，在測定試樣的同時，繪制校準(zhǔn)曲線較為理想。
否則，應(yīng)在測定試樣的同時，平行測定零濃度和中等濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液各兩份，取均值相減后與原校準(zhǔn)曲線上的相應(yīng)點(diǎn)核對。其相對差值根據(jù)方法精密度不得大于5%～10%，否則，應(yīng)重新繪制校準(zhǔn)曲線。
二、如何檢驗校準(zhǔn)曲線
1．線性檢驗
即檢驗校準(zhǔn)曲線的精密度，對于以4～6個濃度單位所獲得的測量信號值繪制的校準(zhǔn)曲線，分光光度法一般要求其相關(guān)系數(shù)|r|≥0.9990，否則應(yīng)找出原因并加以糾正，重新繪制合格的校準(zhǔn)曲線。
2．截距檢驗
即檢驗校準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確度，在線性檢驗合格的基礎(chǔ)上，對其進(jìn)行線性回歸，得出回歸方程y=a+bx，然后，將所得截距a與0作t檢驗，當(dāng)取95%置信水平，經(jīng)檢驗無顯著性差異時，a可做0處理，方程簡化為y=bx，移項得x=y/b。在線性范圍內(nèi)，可代替查閱校準(zhǔn)曲線，直接將樣品測量信號值經(jīng)空白校正后，計算出試樣濃度。
當(dāng)a與0有顯著性差異時，表示校準(zhǔn)曲線的回歸方程計算結(jié)果準(zhǔn)確度不高，應(yīng)找出原因予以校正后，重新繪制校準(zhǔn)曲線并經(jīng)線性檢驗合格。在計算回歸方程，經(jīng)截距檢驗合格后投入使用?；貧w方程如不經(jīng)上述檢驗和處理，就直接投入使用，必將給測定結(jié)果引入差值相當(dāng)于解決a的系統(tǒng)誤差。
3．斜率檢驗
即檢驗分析方法的靈敏度，方法靈敏度是隨實(shí)驗條件的變化而改變的，在完全相同的分析條件下，僅由于操作中的隨機(jī)誤差導(dǎo)致的斜率變化不應(yīng)超出一定的允許范圍，此范圍因分析方法的精度不同而異，例如，一般而言，分子吸收分光光度法要求其相對差值小于5%，而原子吸收分光光度法則要求其相對差值小于10%等。
三、如何正確的控制校準(zhǔn)曲線
被測物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩芤旱姆磻?yīng)稱為顯色反應(yīng)或發(fā)色反應(yīng)，顯色反應(yīng)介質(zhì)的pH條件、顯色劑用量、顯色反應(yīng)的時間和溫度、為消除共存物干擾而加入的掩蔽劑、甚至加試劑的順序，都要按照方法步驟的要求執(zhí)行。有時，標(biāo)準(zhǔn)系列雖然不像實(shí)際試樣那樣組成復(fù)雜，但仍要求與試樣進(jìn)行同樣的處理步驟，以便控制校準(zhǔn)曲線上的數(shù)據(jù)點(diǎn)的空白、回收率等因素。
建立校準(zhǔn)曲線時，測量吸光度的參比有兩種選擇：
第一種方法用純?nèi)軇┳鲄⒈?，兩個比色皿都放溶劑時，“樣品比色皿”的吸光度測定值為比色皿成對性校正值。此后，所有樣品吸光度測定值都須扣除此值，進(jìn)行校正，然后，以純?nèi)軇閰⒈?，測定空白及標(biāo)準(zhǔn)系列的吸光度，繪制校準(zhǔn)曲線。
第二種方法直接用空白為參比，當(dāng)兩個比色皿都放空白時，測定比色皿成對性校正值，然后，測定標(biāo)準(zhǔn)系列的吸光度，繪制校準(zhǔn)曲線。
兩種方法得到的兩條校準(zhǔn)曲線互相平行，但前一種方法可測定空白的水平，后一種方法不能測定空白，理論上校準(zhǔn)曲線通過原點(diǎn)。
若空白為零，兩條校準(zhǔn)曲線重合。
無論用什么作參比，實(shí)樣測定時應(yīng)該使用與建立校準(zhǔn)曲線相同的比色皿和同樣的參比。比色皿的成對性校正對于使用已久的比色皿有必要，尤其是測量吸光度很小的樣品時，校正可保證測量值的可靠性和重復(fù)性。
使用校準(zhǔn)曲線時應(yīng)注意：校準(zhǔn)曲線包括“標(biāo)準(zhǔn)曲線”和“工作曲線”。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)溶液制作校準(zhǔn)曲線時，如果分析步驟與樣品的分析步驟相比有某些省略時，則制作的校準(zhǔn)曲線稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果模擬被分析物質(zhì)的成分，并與樣品完全相同的分析處理，然后，繪制的校準(zhǔn)曲線稱為工作曲線。因此，如果基體效應(yīng)對分析方法至關(guān)重要時，應(yīng)使用含有與實(shí)際樣品類似基體的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行校準(zhǔn)曲線繪制。
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