分光光度法是指應(yīng)用分光光度計的分析方法，具有靈敏、準確、快速及選擇性好等特點。
通常所測樣品溶液濃度下限可達10-6~10-5mol/L，適用于測定食品中的微量組分（如肉制品中的亞硫酸鹽、糖果中的二氧化硫等）。
原理
物質(zhì)對光的選擇性吸收
當光束照射到物質(zhì)上時，光與物質(zhì)發(fā)生相互作用，產(chǎn)生反射、散射、吸收或透射。
若被照射的是均勻溶液，光的散射可以忽略。
溶液顏色的產(chǎn)生
當一束白光通過某一有色溶液時，一些波長的光被溶液吸收，另一些波長的光則透過溶液。
透射光或反射光刺激人眼使人感到顏色的存在。
人把自身能感覺到的光定義為可見光。
在可見光區(qū)，不同波長的光呈現(xiàn)不同的顏色，因此溶液的顏色由透射光的波長所決定。
透射光與吸收光可組成白光，故稱這兩種光互為補色光，兩種顏色互為補色。
光吸收的本質(zhì)
當一束光照射到某物質(zhì)或其溶液時，組成該物質(zhì)的分子、原子或離子與光子發(fā)生“碰撞”;
光子的能量就轉(zhuǎn)移到分子、原子或離子上，是這些粒子由最低能態(tài)（基態(tài)）躍遷到較高能太（激發(fā)態(tài)），這個作用稱為物質(zhì)對光的吸收。
被激發(fā)的粒子約在10-8s后回到基態(tài)，并以熱或熒光等形式釋放出能量。
分子、原子或離子具有不連續(xù)的量子化能級，僅當照射光光子的能量hυ，與被照射物質(zhì)粒子的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量之差相當時，才能發(fā)生吸收。
不同物質(zhì)微粒由于結(jié)構(gòu)不同而具有不同的量子化能級，其基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量差也不相同。
所以物質(zhì)對光的吸收具有選擇性。
吸收曲線
吸收曲線，也稱為吸收光譜，描述了物質(zhì)對不同波長的光的吸收能力。
將不同波長的光透過某一固定濃度和厚度的有色溶液，測量每一波長下有色溶液對光的吸收程度（即吸光度）；
然后以波長為橫坐標，以吸光度為縱坐標作圖，繪制的曲線即為吸收曲線。
不同濃度的同一物質(zhì)，在吸收峰附近的吸光度隨著濃度增加而增大，但最大吸收波長不變。
若在最大吸收波長處測定吸光度，則靈敏度較高。
因此，吸收曲線是分光光度法中選擇測定波長的重要依據(jù)。
光吸收基本定律
即朗伯-比爾定律：
當一束平行單色光通過液層厚度為b的有色溶液時，溶質(zhì)吸收了光能，光的強度就要減弱。
溶液的濃度越大，通過的液層厚度越大，入射光越強，則光被吸收的越多，光強度的減弱也越顯著。
該定律是紫外可見分光光度法等各類吸光光度法定量分析的依據(jù)，是由實驗觀察得到的，不僅適用于溶液，也適用于其他均勻非散射的吸光物質(zhì)。
A=lg(I/I0)=εbc
A-吸光度；
I0-入射光強度，cd；
I-透射光強度，cd；
ε-吸光系數(shù)，L/(mol˙cm)；
b-液層厚度（光程長度），cm；
c-有色溶液的濃度，mol/L。
其物理意義為：
當一束平行單色光通過單一均勻、非散射的吸光物質(zhì)溶液時，溶液的吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。
式中ε是吸光物質(zhì)在特定波長和溶劑的情況下的一個特征常數(shù)，數(shù)值上等于濃度為1mol/L的吸光物質(zhì)在1cm光程中的吸光度。
ε是吸光物質(zhì)吸光能力的量度，ε值越大，方法的靈敏度越高。
由實驗結(jié)果計算ε時，常以被測物質(zhì)的總濃度代替吸光物質(zhì)的濃度，實際上時表觀摩爾吸光系數(shù)。
在多組分體系中，如果各種吸光物質(zhì)之間沒有相互作用，體系的總吸光度等于各組分吸光度之和，即吸光度具有加和性。
透光度T是透射光強度I與入射光強度I0之比，即：
T=I/I0
因此：A=lg(1/T)
在使用分光光度計時，我們必須要注意一些使用后的維護，保養(yǎng)，和一些基本使用注意事項，才能達到更好的使用效果。
分光光度計的使用維護：
1、使用的吸收池必須潔凈，并注意配對使用。量瓶、移液吸管均應(yīng)校正、洗凈后使用。
2、取吸收池時，手指應(yīng)拿毛玻璃面的兩側(cè)，裝盛樣品以池體的4/5為度，使用揮發(fā)性溶液時應(yīng)加蓋，透光面要用擦鏡紙由上而下擦拭干凈，檢視應(yīng)無溶劑殘留。吸收池放入樣品室時應(yīng)注意方向相同。用后用溶劑或水沖洗干凈，晾干防塵保存。
3、供試品溶液濃度除各該品種已有注明外，其吸收度以在0.3～0.7之間為宜。
4、測定時除另有規(guī)定外，應(yīng)以配制供試品溶液的同批溶劑為空白對照，采用1cm石英吸收池，在規(guī)定的吸收峰±2nm以內(nèi)，測幾個點的吸收度或由儀器在規(guī)定的波長附近自動掃描測定，以核對供試品的吸收峰位置是否正確，并以吸收度最大的波長作為測定波長，除另有規(guī)定外吸收度最大波長應(yīng)在該品種項下規(guī)定的測定波長±2nm以內(nèi)。
5、供試品應(yīng)取2份，如為對照品比較法，對照品一般也應(yīng)取2份。平行操作，每份結(jié)果對平均值的偏差應(yīng)在±0.5%以內(nèi)。
6、選用儀器的狹縫寬度應(yīng)小于供試品吸收帶的半寬度，否則測得的吸收度值會偏低，狹縫寬度的選擇應(yīng)以減少狹縫寬度時供試品的吸收度不再增加為準，對于大部分被測品種，可以使用2nm縫寬。
7、單色器是儀器的核心部分,裝在密封盒內(nèi)不能拆開,為防止色散元件受潮發(fā)霉,必須經(jīng)常更換單色器盒干燥劑。
8、光電轉(zhuǎn)換元件不能長時間曝光,應(yīng)避免強光照射或受潮積塵。
由于分光光度計是一種常用的實驗室分析儀器，款式和價格都是多樣化的，因此如何選擇一款合適的分光光度計就顯得尤為重要了。盡管分光光度計種類繁多，但不外乎：簡易型、中檔型和高檔型三大類。
一、簡易型儀器及其特點：
結(jié)構(gòu)：這種類型的儀器多為單光束型，即只有一束光照射到樣品室內(nèi)；光源一般僅有鎢燈；樣品支架一般為推拉式四聯(lián)池架；波長選擇多為手動查找，重復(fù)性差；狹縫為一個固定寬度模式；光學(xué)性能指標較低；檢測器多為光敏二極管；顯示器多為機械表頭或數(shù)碼管顯示器，數(shù)據(jù)處理器一般沒有。此類儀器生產(chǎn)以國內(nèi)廠家居多。
測量模式：多為定點（固定波長）吸光度或透過率測量方式，基本不能進行波長掃描測量。
適應(yīng)范圍：小型實驗室及示范教學(xué)，分析樣品相對簡單，測試結(jié)果精度要求不高。
二、中檔型儀器及其特點：
結(jié)構(gòu)：此類儀器多為雙光束型或準雙光束型，但也有單光束儀器型；光源有鎢燈和氘燈；樣品池支架為兩個固定式，分別是樣品通道和參比通道；波長按照設(shè)定模式自動查找或掃描；狹縫多數(shù)仍為2nm固定寬度模式，也有1.5nm狹縫寬度的；檢測器多數(shù)是硅光二極管，但也有少數(shù)用光電倍增管的；光學(xué)性能相對較高，其中光柵的技術(shù)指標尤為重要，較好的光柵為凹面型，為此無論在分辨率還是在雜散光方面指標要優(yōu)于簡易型儀器；顯示器為液晶式或連接電腦，數(shù)據(jù)處理可由儀器自身具有的或外接計算機處理。并有一定的測量附件。
測量模式：透過率、吸光度、濃度直讀、單光束；單點及掃描均可。
適應(yīng)范圍：此類儀器基本可滿足大多實驗室分析需要。
三、高檔型儀器及特點：
除了中檔儀器的特點外，主要是光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計和制造工藝水平更高了，比如使用了大尺寸的凹面光柵，并且光柵刻槽數(shù)大于1800條/mm；波長檢測范圍有的儀器在近紅外區(qū)已經(jīng)超過1100nm，可達到2600nm；狹縫均為連續(xù)可調(diào)型，以適應(yīng)高分辨率的需要，波長掃描速度的檔位也增加了，檢測器均使用高靈敏度的光電倍增管和紅外檢測器；數(shù)據(jù)處理目前基本是電腦來執(zhí)行；衡量一臺儀器的另外一個指標是看此儀器是否具有豐富的附屬測量器件，如偏振附件、積分球附件、反射附件、自動進樣器附件、色度分析軟件、薄膜附件等等。
測量模式：透過率、吸光度、濃度直讀、反射方式、能量方式，單點、掃描均可；
適應(yīng)范圍：科研、光學(xué)產(chǎn)品的檢測、生化樣品檢測、復(fù)雜樣品檢測等。不但可以測液態(tài)樣品，也可測固態(tài)樣品。
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