紫外及可見光分光光度計的可測波長范圍為200一1000 nm,也有波長范圍為200- 400 nm的紫外分光光度計,但前者較為普遍。紫外及可見光分光光度計的構(gòu)造原理與可見光分光光度計(如721型分光光度計)相似。由于玻璃吸收紫外光,因此單色器要用石英棱鏡或光柵。
(一)光(light source)
有鎢絲燈及氫燈(或氛燈)兩種??梢姽鈪^(qū)(360一1000 nm)使用鎢絲燈;紫外光區(qū) (200一360 nm)則用氫燈或氛燈。
(二)吸收池(absorption cell)
由于玻璃吸收紫外光.吸收池要用石英材質(zhì)。
(三)檢瀏器(detector)
檢側(cè)器使用兩只光電管,一為氧化艷光電管,用于625一1000 nm波長范圍;另一只是銻艷光電管,用于200一625 nm波長范圍。光電倍增管亦為常用的檢測器,其靈敏度比一般的光電管高2個數(shù)量級。
紫外及可見光分光光度計分單光束和雙光束型。單光束型儀器使用前一般需要預(yù)熱以使儀器穩(wěn)定,缺點是難以消除與補償由于光源與電子測量系統(tǒng)不穩(wěn)定等所引致的誤差。雙光束型儀器能夠消除與補償由于光源、電子測量系統(tǒng)不穩(wěn)定等所引致的誤差,所以其測盤的精確度就提高了。
其工作原理可描述為:由光源(鎢絲燈氘燈,根據(jù)波長而變換使用)發(fā)出的光經(jīng)人口狹縫及反射鏡反射至石英棱鏡或光柵,色散后經(jīng)過出口狹縫而得到所需波長的單色光束。然后由反射鏡反射至由馬達(dá)轉(zhuǎn)動的調(diào)制板及扇形鏡上。當(dāng)調(diào)制板以一定轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)時,時而使光束通過,時而擋住光束,因而調(diào)制成一定頻率的交變光束。之后扇形鏡在旋轉(zhuǎn)時,將此交變光束交替地投射到參比溶液(空白溶液)及試樣溶液上,后面的光電倍增管接受通過參比溶液及為試樣溶液所減弱的交變光通量,并使之轉(zhuǎn)變?yōu)闇y量信號。此信號經(jīng)放大并用解調(diào)器分離及整流,然后以電位器自動平衡此兩直流信號的比率,并依照記錄器記錄得到吸收曲線。
紫外可見分光光度計引用新型技術(shù),其功能強(qiáng)大,采用單色器技術(shù),波長范圍190-1100nm,是各種涉及水和廢水分析領(lǐng)域的通用儀器,應(yīng)用范圍包括市政和工業(yè)廢水,飲用水,加工過程用水,地表水,冷卻水和鍋爐補給水等。
紫外可見分光光度計應(yīng)用:
在水和廢水監(jiān)測中的應(yīng)用,對于一個水系的監(jiān)測分析和綜合評價,一般包括水相(溶液本身)、固相(懸浮物、底質(zhì))、生物相(水生生物)。在水質(zhì)的常規(guī)監(jiān)測中,紫外可見分光光度法占有較大的比重。由于水和廢水的成分復(fù)雜多變,待測物的濃度和干擾物的濃度差別很大,在具體分析時必須選擇好分析方法。
在農(nóng)產(chǎn)品和食品分析中可用于檢測的組分或成分有蛋白質(zhì)、賴氨酸、葡萄糖、維生素C、硝酸鹽、亞硝酸鹽、砷、汞等;
在植物生化分析中可用于檢測葉綠素、全氮和酶的活力等;
在飼料分析中可用于檢測煙酸、棉酚、磷化氫和甲酯等。
紫外可見分光光度計維護(hù)要點:
一、溫度和濕度是影響儀器性能的重要因素。他們可以引起機(jī)械部件的銹蝕,使金屬鏡面的光潔度下降,引起儀器機(jī)械部分的誤差或性能下降;造成光學(xué)部件如光柵、反射鏡、聚焦鏡等的鋁膜銹蝕,產(chǎn)生光能不足、雜散光、噪聲等,甚至儀器停止工作,從而影響儀器壽命。維護(hù)保養(yǎng)時應(yīng)定期加以校正。應(yīng)具備四季恒濕的儀器室,配置恒溫設(shè)備,特別是地處南方地區(qū)的實驗室。
二、環(huán)境中的塵埃和腐蝕性氣體也會影響機(jī)械系統(tǒng)的靈活性、降低各種限位開關(guān)、按鍵、光電偶合器的可靠性,也是造成必須學(xué)部件鋁膜銹蝕的原因之一。因此必須定期清潔,保障環(huán)境和儀器室內(nèi)衛(wèi)生條件,防塵等。
三、儀器使用一定周期后,內(nèi)部會積累一定量的塵埃,可以由維修工程師或在工程師指導(dǎo)下定期開啟儀器外罩對內(nèi)部進(jìn)行除塵工作,同時將各發(fā)熱元件的散熱器重新緊固,對光學(xué)盒的密封窗口進(jìn)行清潔,必要時對光路進(jìn)行校準(zhǔn),對機(jī)械部分進(jìn)行清潔和必要的潤滑,最后,恢復(fù)原狀,再進(jìn)行一些必要的檢測、調(diào)校與記錄。
目前,紫外可見分光光度計的應(yīng)用主要是在定量分析方面。先從生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用來介紹。紫外可見分光光度計在生命科學(xué)中應(yīng)用非常廣泛。主要的是以下5個方面。
1.蛋白質(zhì)分析工作中
紫外可見分光光度計在蛋白質(zhì)的分析中,主要的是作蛋白質(zhì)含量檢測;一般是在蛋白質(zhì)的吸收峰上作吸光度測定。因為蛋白質(zhì)對紫外光的主要吸收波長為280nm,所以,采用光度測量模式,將儀器的波長GOTO到蛋白質(zhì)的最大吸收峰波長280nm上,測試其吸光度大小,就可完成對蛋白質(zhì)的定量檢測。
2.核酸分析工作中
紫外可見分光光度計在核酸分析中的應(yīng)用,主要是用來對核酸的定量檢測;因為核酸的吸收峰在260nm。我們只要采用光度測量模式,將紫外可見分光光度計的波長GOTO到核酸的最大吸收峰260nm上,測試其吸光度大小就是了。
3.氨基酸分析工作中
紫外可見分光光度計在氨基酸分析中的應(yīng)用,主要是用來對氨基酸的定量檢測。因為氨基酸對紫外光的主要吸收波長為230nm,所以,我們只要采用光度測量模式,將紫外可見分光光度計儀器的波長GOTO到氨基酸的最大吸收峰230nm上,就可測試其吸光度大小,從而計算出氨基酸的含量。但是,因為氨基酸分析時,一般是將它溶解在水中,而水在230nm附近有很多干擾吸收線,所以,在用紫外可見分光光度計對氨基酸分析檢測時,要注意防止干擾的問題。此外,還需注意:只有少數(shù)氨基酸有紫外吸收,多數(shù)氨基酸無紫外吸收或很弱,測定時要衍生化后再測。
4.糖類分析測試工作中
紫外可見分光光度計在糖的分析中,主要是作定量檢測。因為糖對紫外光的主要吸收波長為218nm,所以,對糖類進(jìn)行分析時,只要采用光度測量模式,將紫外可見分光光度計儀器的波長GOTO到氨基酸的最大吸收峰218nm上,就可測試其吸光度大小,從而計算出糖的含量。
5.多糖分析測試工作中
紫外可見分光光度計在多糖的分析中,主要也是作定量檢測。因為多糖對紫外光的主要吸收波長為206nm,所以,我們只要采用光度測量模式,將紫外可見分光光度計儀器的波長GOTO到多糖的最大吸收峰206nm上,就可測試其吸光度大小,從而計算出多糖的含量。
但是多糖的分析難度很大。因為,在206nm處的時候,光源(氘燈)的能量已經(jīng)很弱,儀器光學(xué)系統(tǒng)的能量輸出也很低,光電倍增管的靈敏度也很低,206nm左右的干擾也很大。所以,用紫外可見分光光度計作多糖的分析是很難的事,目前許多科學(xué)家正在研究中。