分光光度計是利用物質(zhì)對光的選擇性吸收進行物質(zhì)的定性或定量分析的儀器，在各行各業(yè)得到了廣泛應(yīng)用，主要用于物質(zhì)純度檢查、定量分析、物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒別等?？蓽y量結(jié)果總會出現(xiàn)可接受或不可接受的誤差，誤差來源于測量過程的各個方面，主要來源于儀器本身性能和測量條件的選擇兩個方面。
一、儀器本身性能帶來的誤差
1.1復(fù)色光對比耳定律的偏離
比耳定律成立的前提條件是人射光是單色光，但是精度再高的儀器，即使是雙單色器的分光光度計，也只能獲得近乎單色的光，無法獲得純單色光，它仍然含有狹窄光通帶，具有復(fù)色光的性質(zhì)。而復(fù)色光會導(dǎo)致比耳定律的正或負偏離。固定狹縫的紫外分光光度計光譜帶寬一般為1nm或2nm，可調(diào)狹縫的可以做到0.Inm；可見分光光度計帶寬6nm、snm，甚至十幾納米。光譜帶寬應(yīng)該是越小越好，但是隨著光譜分辨率的提高，儀器的靈敏度降低，所以選擇儀器時要綜合考慮各種條件的影響。當溶液濃度較小且單色光較純時，可近似認為符合比耳定律。
1.2雜散光的影響
雜散光是指進人檢測器的處于待測波長光譜帶寬范圍外的其他波長組分，它是光譜測量中誤差的主要來源。產(chǎn)生原因有:分光光度計的色散元件、反射鏡、透鏡及單色器內(nèi)壁灰塵等。在分光光度計工作波段邊緣波長處，由于單色器透光率、光源輻射強度、檢測器靈敏度都較低，雜散光的影響更為顯著。雜散光限制儀器的分析上限可引起嚴重的測量誤差，實際工作中，在定量分析時，一般在吸收峰或其附近處測量樣品吸光度，如果在分析波長處含有雜散光，這時樣品的透光率較小，而雜散光大部分透過，使測量吸光度低于真實吸光度。
1.3儀器噪聲對測t的影響
儀器噪聲也是儀器的一個重要指標，它表征儀器做稀溶液的能力。是疊加在待測量的分析信號中的不需要的信號，掃描100%T和0%T線，可觀察到分光光度計的絕對噪聲水平，如果儀器噪聲較大，會掩蓋較小的測量信號，一般用噪音的二倍來表示儀器的靈敏度。
1.4波長和吸光度準確度
樣品的每一個值都是在一定的波長下測得的，如果波長誤差很大，測出的值肯定不準。吸光度準確度也是用戶對儀器的直接要求，更應(yīng)引起足夠的重視。國家計量檢定規(guī)程規(guī)定雙光束紫外可見分光光度計透射比準確度為A級士0.6%， B級土1.0%。
二、測量條件的選擇
2.1參比溶液和溶荊的選擇
分光光度計的測量實際上是以通過參比池的光強度作為人射光強度來測定試樣的吸光度，先調(diào)節(jié)儀器使透過參比池溶液的吸光度為零，然后讓同一束光通過樣品，使得吸光度比較真實地反映待測物質(zhì)的濃度，所以參比溶液的選擇非常重要。如果僅有待測物質(zhì)與顯色劑的反應(yīng)產(chǎn)物有吸收，可用純?nèi)軇┗蛘麴s水作參比溶液。如果顯色劑有顏色，并在測定波長下有吸收，則用顯色劑溶液作參比溶液，所加人顯色劑及其它試劑的量，與試樣中的加入量應(yīng)一致。如果樣品中其它組分本身的顏色對測定有干擾，而所用顯色劑沒顏色，則用不加顯色劑的樣品溶液作參比液。
正確選擇合適的溶劑，對提高分析的準確度起重要作用。為減小溶劑中雜質(zhì)的影響，應(yīng)選擇高純度的溶劑；溶劑應(yīng)不與待測物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；待測物在溶劑中要有一定的溶解度；在測定的波長范圍內(nèi)，溶劑本身沒有吸收，注意常用溶劑的最短可用波長；當用揮發(fā)性大的溶劑時，測量過程中吸收池應(yīng)加蓋。
2.2測試波長的選擇
當用分光光度計對溶液進行測定時，首先需要選擇合適的測量波長。選擇的依據(jù)是該被測溶液的吸收曲線。在一般情況下，我們總是選擇最大吸收波長作為測量波長，這樣可以提高靈敏度。而在有些情況下最大吸收峰很尖銳、吸收過大或附近有干擾存在，就不能選最大吸收波長，而必須在保證有一定靈敏度的情況下，選擇吸收曲線中的其它波長進行測定（曲線較平坦處對應(yīng)的波長），以消除干擾。繪制吸收曲線是正確選擇波長的有效手段和方法。
除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。
蛋白質(zhì)的直接定量(UV法)
這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm的“背景”信息，設(shè)定此功能“開”。與測試核酸類似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，較佳的線性范圍在1.0-1.5之間。實驗中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個正常的現(xiàn)象。事實上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因為Warburg公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾;另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
比色法蛋白質(zhì)定量
蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的混合物，比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸(如酪氨酸，絲氨酸)與外加的顯色基團或者染料反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。
分光光度計是利用物質(zhì)對光的選擇性吸收進行物質(zhì)的定性或定量分析的，在各行各業(yè)得到了廣泛應(yīng)用，主要用于物質(zhì)純度檢查、定量分析、物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒別等?？蓽y量結(jié)果總會出現(xiàn)可接受或不可接受的誤差，誤差來源于測量過程的各個方面，我認為主要來源于儀器本身性能和測量條件的選擇兩個方面。
1、儀器本身性能帶來的誤差
1.1復(fù)色光對比耳定律的偏離
比耳定律成立的前提條件是人射光是單色光，但是精度再高的儀器，即使是雙單色器的分光光度計，也只能獲得近乎單色的光，無法獲得純單色光，它仍然含有狹窄光通帶，具有復(fù)色光的性質(zhì)。而復(fù)色光會導(dǎo)致比耳定律的正或負偏離。固定狹縫的紫外分光光度計光譜帶寬一般為1nm或2nm，可調(diào)狹縫的可以做到0.Inm;可見分光光度計帶寬6nm、snm，甚至十幾納米。光譜帶寬應(yīng)該是越小越好，但是隨著光譜分辨率的提高，儀器的靈敏度降低，所以選擇儀器時要綜合考慮各種條件的影響。當溶液濃度較小且單色光較純時，可近似認為符合比耳定律。
1.2雜散光的影響
雜散光是指進人檢測器的處于待測波長光譜帶寬范圍外的其他波長組分，它是光譜測量中誤差的主要來源。產(chǎn)生原因有:分光光度計的色散元件、反射鏡、透鏡及單色器內(nèi)壁灰塵等。在分光光度計工作波段邊緣波長處，由于單色器透光率、光源輻射強度、檢測器靈敏度都較低，雜散光的影響更為顯著。雜散光限制儀器的分析上限可引起嚴重的測量誤差，實際工作中，在定量分析時，一般在吸收峰或其附近處測量樣品吸光度，如果在分析波長處含有雜散光，這時樣品的透光率較小，而雜散光大部分透過，使測量吸光度低于真實吸光度。
1.3儀器噪聲對測t的影響
儀器噪聲也是儀器的一個重要指標，它表征儀器做稀溶液的能力。是疊加在待測量的分析信號中的不需要的信號，掃描100%T和0%T線，可觀察到分光光度計的絕對噪聲水平，如果儀器噪聲較大，會掩蓋較小的測量信號，一般用噪音的二倍來表示儀器的靈敏度。
1.4波長和吸光度準確度
樣品的每一個值都是在一定的波長下測得的，如果波長誤差很大，測出的值肯定不準。吸光度準確度也是用戶對儀器的直接要求，更應(yīng)引起足夠的重視。國家計量檢定規(guī)程規(guī)定雙光束紫外可見分光光度計透射比準確度為A級士0.6%, B級土1.0%。
2、測量條件的選擇
2.1參比溶液和溶荊的選擇
分光光度計的測量實際上是以通過參比池的光強度作為人射光強度來測定試樣的吸光度，先調(diào)節(jié)儀器使透過參比池溶液的吸光度為零，然后讓同一束光通過樣品，使得吸光度比較真實地反映待測物質(zhì)的濃度，所以參比溶液的選擇非常重要。如果僅有待測物質(zhì)與顯色劑的反應(yīng)產(chǎn)物有吸收，可用純?nèi)軇┗蛘麴s水作參比溶液。如果顯色劑有顏色，并在測定波長下有吸收，則用顯色劑溶液作參比溶液，所加人顯色劑及其它試劑的量，與試樣中的加入量應(yīng)一致。如果樣品中其它組分本身的顏色對測定有干擾，而所用顯色劑沒顏色，則用不加顯色劑的樣品溶液作參比液。
正確選擇合適的溶劑，對提高分析的準確度起重要作用。為減小溶劑中雜質(zhì)的影響，應(yīng)選擇高純度的溶劑;溶劑應(yīng)不與待測物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng);待測物在溶劑中要有一定的溶解度;在測定的波長范圍內(nèi)，溶劑本身沒有吸收，注意常用溶劑的最短可用波長;當用揮發(fā)性大的溶劑時，測量過程中吸收池應(yīng)加蓋。
2.2測試波長的選擇
當用分光光度計對溶液進行測定時，首先需要選擇合適的測量波長。選擇的依據(jù)是該被測溶液的吸收曲線。在一般情況下，我們總是選擇最大吸收波長作為測量波長，這樣可以提高靈敏度。而在有些情況下最大吸收峰很尖銳、吸收過大或附近有干擾存在，就不能選最大吸收波長，而必須在保證有一定靈敏度的情況下，選擇吸收曲線中的其它波長進行測定(曲線較平坦處對應(yīng)的波長)，以消除干擾。繪制吸收曲線是正確選擇波長的有效手段和方法。
2.3吸光度范圍的選擇
試樣在不同吸光度時，濃度的相對誤差不同，一般選擇A二0.2一0.8之間，濃度相對誤差較小，可以通過改變吸收池厚度、檢測波長或待測溶液濃度，使吸光度讀數(shù)在適宜范圍內(nèi)。
2.4狹縫寬度的選擇
狹縫寬度不僅影響光譜的純度，也影響吸光度值，在定量分析時，為了得到足夠的測量信號，應(yīng)采用較大狹縫。在定性分析時，為了提高分辨率，應(yīng)采用較小狹縫，以獲得精細的光譜結(jié)構(gòu)。
2.5吸收池的選擇和使用
吸收池的規(guī)格應(yīng)根據(jù)被測溶液顏色深淺來確定，一般是被測溶液顏色深時選光程短的，顏色淺時選光程長的，同一實驗使用同一規(guī)格同一套吸收池。在定量測量之前需要對吸收池作校正和配對工作，吸收池不匹配時，對測量產(chǎn)生誤差，吸收池方向不同，透光率亦有差異，使用時應(yīng)注意方向。比色皿毛玻璃一面的上端有一個箭頭，應(yīng)與光路保持一致。另外，使用時，不要把溶液注得太滿，以防在推動比色皿架時溶液溢出皿外。如透光壁外有溶液存在，要擦干再測，否則將產(chǎn)生誤差。
2.6溫度的選定
溫度對溶液顏色的深淺和吸光度都有影響，溫度升高，紫外一可見光譜吸收向短波方向移動。故在繪制標準曲線和測定樣品時，應(yīng)保持溫度一致，通常在室溫條件下進行。
由于分光光度計引起的測量總誤差除來自自身性能、測量條件外，還來自于分析過程的各個步驟，如試樣處理、分離富集等，可能由于化學(xué)操作引起待測組分的損失和雜質(zhì)的引人。所以出現(xiàn)不可接受的測量誤差時要從多方面分析。
儀器的正確使用和保養(yǎng)也很重要，我們應(yīng)該做到以下幾點:堅持標準溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，不使用過期溶液;比色皿應(yīng)保持清潔、干燥，禁止用硬物碰擦透明表面;防止儀器振動，影響測量穩(wěn)定性;在開機狀態(tài)，不測量時，應(yīng)打開樣品池門，延長壽命;樣品集中測量，避免開機次數(shù)，延長光源壽命;一旦停機，則應(yīng)待燈冷卻后再重新啟動，并預(yù)熱15 min左右再使用;要經(jīng)常更換儀器的干燥劑，防止光學(xué)元件和光電傳感器受潮生霉;儀器搬動或更換重要部件后，要重新進行性能確認，以保證測量結(jié)果的準確。
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