紫外分光光度法是根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜，來研究物質(zhì)的成分、結(jié)構(gòu)和物質(zhì)間相互作用的有效手段。
物質(zhì)的吸收光譜就是物質(zhì)中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波長的光能量，相應(yīng)地發(fā)生了分子振動能級躍遷和電子能級躍遷的結(jié)果。
由于各種物質(zhì)具有各自不同的分子、原子和不同的分子空間結(jié)構(gòu)，其吸收光能量的情況也就不會相同；
因此，每種物質(zhì)就有其特有的、固定的吸收光譜曲線，可根據(jù)吸收光譜上的某些特征波長處的吸光度的高低判別或測定該物質(zhì)的含量。
一般地，紫外可見分光光度計主要由光源系統(tǒng)、單色器系統(tǒng)、樣品室、檢測系統(tǒng)組成。
光源發(fā)出的復(fù)合光通過單色器被分解成單色光，當(dāng)單色光通過樣品室時；
一部分被樣品吸收，其余未被吸收的光到達(dá)檢測器，被轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，?jīng)電子電路的放大和數(shù)據(jù)處理后，通過顯示系統(tǒng)給出測量結(jié)果。
光源：發(fā)出所需波長范圍內(nèi)的連續(xù)光譜，有足夠的光強(qiáng)度，穩(wěn)定。
可見光區(qū)：鎢燈，碘鎢燈(320～2500nm)紫外區(qū)：氫燈，氘燈(180～375nm)；氙燈：紫外、可見光區(qū)均可用作光源。
單色器：將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置。
棱鏡：依據(jù)不同波長光通過棱鏡時折射率不同。
光柵：在鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大的等寬度等間距條痕(600、1200、2400條/mm)。利用光通過光柵時發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光。
吸收池：用于盛待測及參比溶液?？梢姽鈪^(qū)：光學(xué)玻璃池；紫外區(qū)：石英池。
檢測器：利用光電效應(yīng)，將光能轉(zhuǎn)換成電流訊號。光電池，光電管，光電倍增管。
檢流計（指示器）：刻度顯示或數(shù)字顯示、自動掃描記錄。
目前,紫外可見分光光度計的應(yīng)用主要是在定量分析方面。先從生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用來介紹。紫外可見分光光度計在生命科學(xué)中應(yīng)用非常廣泛。主要的是以下5個方面。
1.蛋白質(zhì)分析工作中
紫外可見分光光度計在蛋白質(zhì)的分析中,主要的是作蛋白質(zhì)含量檢測;一般是在蛋白質(zhì)的吸收峰上作吸光度測定。因為蛋白質(zhì)對紫外光的主要吸收波長為280nm,所以,采用光度測量模式,將儀器的波長GOTO到蛋白質(zhì)的最大吸收峰波長280nm上,測試其吸光度大小,就可完成對蛋白質(zhì)的定量檢測。
2.核酸分析工作中
紫外可見分光光度計在核酸分析中的應(yīng)用,主要是用來對核酸的定量檢測;因為核酸的吸收峰在260nm。我們只要采用光度測量模式,將紫外可見分光光度計的波長GOTO到核酸的最大吸收峰260nm上,測試其吸光度大小就是了。
3.氨基酸分析工作中
紫外可見分光光度計在氨基酸分析中的應(yīng)用,主要是用來對氨基酸的定量檢測。因為氨基酸對紫外光的主要吸收波長為230nm,所以,我們只要采用光度測量模式,將紫外可見分光光度計儀器的波長GOTO到氨基酸的最大吸收峰230nm上,就可測試其吸光度大小,從而計算出氨基酸的含量。但是,因為氨基酸分析時,一般是將它溶解在水中,而水在230nm附近有很多干擾吸收線,所以,在用紫外可見分光光度計對氨基酸分析檢測時,要注意防止干擾的問題。此外,還需注意:只有少數(shù)氨基酸有紫外吸收,多數(shù)氨基酸無紫外吸收或很弱,測定時要衍生化后再測。
4.糖類分析測試工作中
紫外可見分光光度計在糖的分析中,主要是作定量檢測。因為糖對紫外光的主要吸收波長為218nm,所以,對糖類進(jìn)行分析時,只要采用光度測量模式,將紫外可見分光光度計儀器的波長GOTO到氨基酸的最大吸收峰218nm上,就可測試其吸光度大小,從而計算出糖的含量。
5.多糖分析測試工作中
紫外可見分光光度計在多糖的分析中,主要也是作定量檢測。因為多糖對紫外光的主要吸收波長為206nm,所以,我們只要采用光度測量模式,將紫外可見分光光度計儀器的波長GOTO到多糖的最大吸收峰206nm上,就可測試其吸光度大小,從而計算出多糖的含量。
但是多糖的分析難度很大。因為,在206nm處的時候,光源(氘燈)的能量已經(jīng)很弱,儀器光學(xué)系統(tǒng)的能量輸出也很低,光電倍增管的靈敏度也很低,206nm左右的干擾也很大。所以,用紫外可見分光光度計作多糖的分析是很難的事,目前許多科學(xué)家正在研究中。
我們在選購紫外可見分光光度計應(yīng)當(dāng)多做比較，多做判斷。下面為大家詳細(xì)介紹紫外可見分光光度計的選購指南：
1、光度準(zhǔn)確度光度準(zhǔn)確度指實際測量的光度讀數(shù)值與真值之差。它是用戶對儀器的直接要求，每個用戶都必須重視。
2、雜散光它指不應(yīng)該有光的地方有了光。它是光譜測量中誤差的主要來源。這個值當(dāng)然越小越好了。
3、光譜帶寬指從單色器射出的單色光譜線強(qiáng)度輪廓曲線的1/2高度處的譜帶寬度。表征儀器的光譜分辨率。按照比耳定律，光譜帶寬應(yīng)該是越小越好的，但是如果儀器的光源能量弱，光學(xué)傳感器的靈敏度低時，光譜帶寬小了，也得不到理想的測量結(jié)果的。所以，選擇和使用儀器時一定注意。
4、穩(wěn)定性穩(wěn)定性是使用者較為關(guān)注的指標(biāo)之一。儀器的宗旨就是穩(wěn)定可靠，不穩(wěn)定更談不上可靠了。
5、噪聲噪聲也是儀器的重要指標(biāo)之一。它表征儀器的做稀溶液的能力。這個指標(biāo)也是越小越好。
6、波長的準(zhǔn)確度和重復(fù)性儀器的每個值都是在一定的波長下測得的，如果所示的波長和實際波長偏差萬里，那么測出的值和真值的吻合度從何談起呢？可見這個指標(biāo)的重要性。
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