氣相色譜儀或液相色譜儀操作中，當儀器的操作條件保持不變時，任一物質(zhì)的色譜峰總是在色譜圖上固定的位置出現(xiàn)，即有一定的保留值。又包含：死時間，保留時間，校下保留時間，保留體積等等。
在液相色譜儀中保留值定性的方法主要是用直接與已知標準物對照的方法。當未知峰的保留值（t'R或V'R）與某一已知標準物完全相同時，則未知峰可能與此已知標準物是同一物質(zhì)，特別是在改變色譜柱或改變洗脫液的組成時，未知峰的保留值與已知標準物的保留值仍能完全相同，則可以基本上認定未知峰與標準物是同一物質(zhì)。
在利用保留值數(shù)據(jù)進行比對和定性分析時要特別注意到：由于液相色譜柱的填柱技術(shù)較復雜，液相色譜儀所使用的色譜柱的重現(xiàn)性目前還很不理想，即使是同一批號的柱子，重現(xiàn)性也不一致，這就使得使用保留值數(shù)據(jù)進行分析受到限制。因此，目前保留值數(shù)據(jù)只能作為定性分析的參考?？梢愿鶕?jù)這些數(shù)據(jù)和對樣品的了解來選用已知標準物，再用這些已知標準物與未知物在同一色譜條件下直接進行對比。
簡單的保留值定性方法是將已知標準物質(zhì)加到樣品中去，若使某一峰增高，而且在改變色譜柱或洗脫液的組成后，仍能使這個峰增高，則可基本認定這個峰所代表的組分與已知標準物質(zhì)為同一物質(zhì)。
目前一些液相色譜儀儀器配備了三維圖譜檢測器，如二極管陣列檢測器，在進行未知組分與已知標準物質(zhì)比對時，除了比較保留時間外，還可以比較兩個峰的立體圖形。如在使用二極管陣列檢測器時，除了比較未知組分與已知標準物質(zhì)的保留時間外，還可比較兩者的紫外光譜圖，如果保留時間一樣，兩者的紫外光譜圖也完全一樣，則可基本上認定兩者是同一物質(zhì)；若保留時間雖一樣，但兩者的紫外光譜圖有較大差別，則兩者不是同一物質(zhì)。這種利用三維圖譜比較對照的方法大大提高了保留值比較定性方法的準確性。美國Bio-Rad公司的血藥分析儀（Remeeli）就是依靠三維圖譜的綜合數(shù)據(jù)的分析來鑒別未知藥物的。
液相色譜儀作為分析實驗室高端必備儀器之一，是實驗室分析員應(yīng)用頻率較高的儀器，縱然是經(jīng)常使用的經(jīng)驗豐富的老司機在使用過程里不可避免的還是往往疏忽一些問題，從而導致一些儀器的故障。方便快速的分析過程固然重要，但是為了多種樣品而忽略了一些細節(jié)步驟，總是會犯些錯。在使用液相色譜儀時四大關(guān)鍵因素，對正確使用極為重要，下面給大家說說：
1、液相色譜儀本身：
對于儀器本身一般不會有問題，特別是剛買回來的新儀器。對于儀器本身重要的就是儀器的校驗，剛買回來的儀器一般都是由賣家先對儀器做系統(tǒng)的確認工作（包括IQ、PQ、OQ），確認順利通過后，再請國家或省級儀器檢定局的來校驗，檢定合格后就可以放心使用了，除此之外，一些做得好的公司每半年會對儀器進行一次的內(nèi)部校驗，目的就是為了保證儀器的正?？蛇\行狀態(tài)。
2、色譜條件：
色譜條件一般包括流動相、色譜柱、檢測波長、流速及進樣量。
流動相就涉及到配制流動相所用到的水和試劑試液，水一般要求用超純水或其他水的電阻率不大于18、2兆歐級別，試劑試液要求用色譜級別的，原因為防止水和試劑試液中的雜質(zhì)對色譜結(jié)果的干擾。
色譜柱會因不同的品種而有不同的要求，但每根色譜柱都有它的清洗要求，這個在色譜柱說明書上都可以找到，一定要根據(jù)上面的要求進行，否則會造成色譜柱效下降和色譜柱的使用壽命縮短，檢測波長也會因品種的不同有不同的要求，這里需要指出的是要注意觀察檢測器氘燈能量的變化，比如基線波動大，活性成分的響應(yīng)值突然變小等，都有可能是氘燈的能量不足所引起的，氘燈一般建議使用800小時，但實際上使用時間不止，可根據(jù)實際情況更換。
流速也因品種的不同而不同，一般為1、0ml/min，流速是不可隨意改動的，特別是作為QC人員，但是作為研發(fā)人員，有時為了摸索條件或進行方法耐用性驗證，會對流速進行改變以評價方法的適用性。對于進樣量因不同的品種也有不同規(guī)定，如果使用六通閥自動進樣，一般進樣精密度都很好，不需強調(diào)什么。
3、操作人員：
首先，作為液相色譜儀操作人員，一定要認真學習液相的說明書，掌握液相硬件和軟件的操作，掌握日常的維護保養(yǎng)，掌握最基礎(chǔ)故障的排除和維修。
一般液相色譜儀的操作規(guī)程也是有操作人員起草的，所以只要嚴格按照操作要求進行操作，一般不會出現(xiàn)問題，當然這里需要特別指出的是對于液相的日常維護保養(yǎng)很重要，比如流動相的過濾、脫氣、泵密封墊的清洗、系統(tǒng)管路的清洗、溶劑過濾頭的清洗等，倘若不堅持，很容易導致色譜柱堵塞、系統(tǒng)壓力過強、色譜峰異常等不必要的故障，浪費時間。
其次，操作人員在配制液相色譜儀分析用待測樣品溶液時，由同一個人單獨完成，以免不必要的偶然誤差從而造成分析的失敗或誤差。
4、液相安裝環(huán)境：
液相色譜儀應(yīng)盡量安裝于水平、遠離振動、電磁干擾的屋內(nèi)的臺面上，有條件的話盡量將液相數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分隔開，一個是防止色譜基線噪音偏大，基線不穩(wěn)等，一個是為減少對人體的危害。
首先從常規(guī)的幾個部件做個簡單的分析。
(一)輸液泵應(yīng)具備如下性能：
①RSD(流量穩(wěn)定性)<0.3%;
?、诹髁糠秶鷮挘?.1～5.0ml/min內(nèi)連續(xù)可調(diào)，有的實驗則需要更大流量;
③輸出壓一般應(yīng)能達到150~400kg/cm2,流量越大,最高壓力越低;
?、芤焊兹莘e小,有助于減少流動相死體積，利于清洗。
⑤密封性能好，耐腐蝕。
(二)檢測器
?、僮贤鈾z測器，分為可變單波長檢測器VWD和二極管陣列檢測器DAD，可以檢測有紫外吸收的物質(zhì)
?、?font color="#0268CA">熒光檢測器，檢測有熒光的物質(zhì)
?、垡暡钫酃鈾z測器，通用型檢測器，但對環(huán)境要求極為苛刻，而且靈敏度低
?、蹺LSD，蒸發(fā)光散射檢測器
?、軲SD，質(zhì)譜檢測器
常用的是紫外檢測，然后是MSD和ELSD
(三)色譜柱
要求柱效高、選擇性好，分析速度快等。目前市場上銷售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、有機聚合物微球(包括離子交換樹脂)、氧化鋁、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10μm等，柱效理論值可達5~16萬/米。
一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效;同系物分析500即可;難分離物則可用2萬的柱子。
因此一般10~30cm左右的柱長基本能滿足復雜混合物分析的需要。所以要根據(jù)自己實際情況來選擇合適的柱子。
柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達到較佳效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結(jié)構(gòu)(盡可能減少填充床以外的死體積)及裝填技術(shù)。即使可以的裝填技術(shù)，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對柱效的影響遠遠大于管壁效應(yīng)。
此外，溫度在色譜分析中是個不容忽視的環(huán)境條件，環(huán)境溫度對溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動相的粘度都有影響。而且不同的檢測器對溫度的敏感度不一樣。保持恒定的溫度對實驗而言是個絕對不容忽視的條件，因此也要留意注溫箱的選擇。以保證實驗結(jié)果的準確性。
(四)進樣器
進樣裝置要求：密封性好，重復性好，死體積小，保證中心進樣，進樣時對色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。而且進樣方式多種多樣，可分為隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。自動進樣器則是市場發(fā)展的趨勢。
(五)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
一般專業(yè)的液相色譜儀生產(chǎn)廠家都有自己配套的液相色譜儀控制軟件。但有不少液相色譜儀可以使用通用型的色譜數(shù)據(jù)工作站進行數(shù)據(jù)計算處理。進口軟件價格比較高，這個自己得根據(jù)資金選擇了。
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