1、高效液相色譜儀的基本工作原理
高效液相色譜儀如圖1所示，是由溶液貯器、高壓泵、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜分離柱、檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)幾部分組成。
高壓泵從溶液貯器中抽走流動(dòng)相，流經(jīng)整個(gè)儀器系統(tǒng)，形成密閉的液體流路。樣品通過進(jìn)樣系統(tǒng)注入色譜分離柱，在柱內(nèi)進(jìn)行分離。柱流出液進(jìn)入檢測(cè)器，使已被分離的組分逐一被檢測(cè)器收集，并將響應(yīng)值轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)后經(jīng)放大被數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜峰，通過數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)記錄的峰值進(jìn)行存儲(chǔ)和計(jì)算[1]。
液相色譜儀是依靠色譜柱進(jìn)行分離的。研究證明：物質(zhì)的色譜過程是指物質(zhì)分子在相對(duì)運(yùn)動(dòng)的兩相(液相和固相)中分配“平衡”的過程。液相色譜是以具有吸附性質(zhì)的硅膠顆粒為固定相，各種洗脫液為流動(dòng)相。當(dāng)液體樣品在載體流動(dòng)相的推動(dòng)下，在液-固兩相間作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，由于各組分在兩相中的分配系數(shù)(K)不同，則使各自的移動(dòng)速度不同，即產(chǎn)生差速遷移。各組分在兩相間經(jīng)過多次分配，從而達(dá)到使混合物分離的目的。
2、輸液泵的常見故障及對(duì)策：
輸液泵/高壓泵是保證HPLC系統(tǒng)流路暢通、流量精確和壓力穩(wěn)定的重要儀器部件，目前多用往復(fù)式恒流柱塞泵，主要由柱塞桿、密封墊圈和兩個(gè)單向閥組成，用馬達(dá)帶動(dòng)凸輪驅(qū)動(dòng)柱塞桿作吸液和排液的往復(fù)運(yùn)動(dòng)。常分為單柱塞泵、并聯(lián)柱塞泵、串聯(lián)柱塞泵和柱塞隔膜泵等類型。流動(dòng)相混合方式分為低壓混合和高壓混合。常見泵的故障主要有以下幾種，并提供解決的辦法。
2.1單向閥故障 由于球與閥座密封不嚴(yán)，液體倒流，造成壓力不穩(wěn)，甚至球與閥座粘在一起阻死。密封不嚴(yán)主要是污染或氣泡引起，球與閥座粘連也是由于污染和磨損造成。
為避免單向閥中的寶石球和閥座被污染，流動(dòng)相應(yīng)使用HPLC級(jí)的溶劑，并且配好的流動(dòng)相一定要用0.45u濾膜過濾和脫氣。如果泵被微粒污染，可分別用水、甲醇、異丙醇、二氯甲烷依次沖洗。沖洗時(shí)應(yīng)打開泄液閥，最后再用所用的溶液沖洗整個(gè)系統(tǒng)。
氣泡進(jìn)入閥中會(huì)緊貼在閥體的一側(cè)，使寶石球難返回到閥座，引起倒流，泵的壓力和流速會(huì)明顯改變。此時(shí)，應(yīng)立即打開泄液閥，大流量(2ml/min)沖洗泵，直至排除液為直線型。因?yàn)榧状伎蓾櫇癖脙?nèi)壁，擠出氣泡，故也可使用脫過氣的甲醇沖洗泵。長期不用的泵或新裝的泵頭應(yīng)該用甲醇趕氣泡。泵進(jìn)氣泡也可在泵頭上排氣泡，即用扳手固定住進(jìn)氣泡的泵頭，擰開輸出管道的壓帽，手動(dòng)泵送液，可見到氣泡從孔中擠壓出來，直至無氣泡排出將壓帽擰緊。
采取上述辦法仍不能使壓力穩(wěn)定，應(yīng)考慮是否密封墊壞了？或單向閥磨損、球不光滑等，需更換部件。
2.2泵墊圈故障泵墊圈常見的故障是滲漏和墊圈受損污染系統(tǒng)。液相色譜系統(tǒng)一般情況下不要使用強(qiáng)酸強(qiáng)堿溶液，因?yàn)檫@會(huì)損壞密封墊和柱塞桿。密封墊圈與運(yùn)動(dòng)著的柱塞桿緊密接觸，可使柱塞在泵頭自由運(yùn)動(dòng)而流動(dòng)相不漏出來，它是液相色譜系統(tǒng)中最易磨損的部件。有條件的實(shí)驗(yàn)室可三個(gè)月更換一次墊圈，防止泵系統(tǒng)污染。如果用緩沖鹽作流動(dòng)相則更會(huì)加速墊圈的磨損，應(yīng)及時(shí)沖洗。當(dāng)墊圈損壞時(shí)，表現(xiàn)為：泵壓力不穩(wěn)、泵頭漏液。一旦出現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象，應(yīng)盡快更換新墊圈。
為避免上述故障的發(fā)生，我們?cè)诜治龉ぷ髦袘?yīng)注意以下幾點(diǎn)：
① 使用超純水(18MΩ.cm)、純度級(jí)別較高的試劑和色譜級(jí)溶劑配制流動(dòng)相；
?、?配好的流動(dòng)相一定要抽濾脫氣，即便儀器有在線脫氣裝置，也可以在上機(jī)前進(jìn)行抽濾。真空抽濾既過濾顆粒也脫了氣泡，非常有效。
?、?泵在起動(dòng)前一定要通過泄液閥抽凈泵里的空氣。
?、?用緩沖鹽洗脫時(shí)，分析結(jié)束后一定要用水沖洗泵和整個(gè)流路系統(tǒng)，不要讓腐蝕性溶液滯留泵中，最后用有機(jī)溶劑充滿系統(tǒng)。
3、色譜分離柱的使用與維護(hù)
在前述儀器工作原理部分，我們已經(jīng)指出，液相色譜儀的分離是在色譜分離柱中實(shí)現(xiàn)的。我們目前工作中多采用反相色譜柱，如何保護(hù)好分離柱減少柱的污染是延長柱壽命的關(guān)鍵。
3.1怎樣維護(hù)好色譜分離柱
加保護(hù)柱(預(yù)柱)是保護(hù)分離柱的有效辦法。保護(hù)柱是根內(nèi)裝填料與分離柱性質(zhì)相近的短柱，接在分離柱之前，或代替流路過濾器。保護(hù)柱的作用是收集和阻塞分離柱口的化學(xué)垃圾，這些垃圾如果直接進(jìn)入分離柱會(huì)逐漸堆積在柱頭，最終降低柱效能。保護(hù)柱是消耗品，如分析血漿樣品，一般分析50個(gè)樣品后需更換新柱芯。
避免高壓沖擊分離柱。一般色譜柱都能承受得起高壓，但經(jīng)不住突然變化的高壓沖擊，這將改變柱床體積，影響柱效。引起高壓沖擊的原因主要有：進(jìn)樣器的樣品閥的緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)、泵啟動(dòng)太快、柱切換等操作。用手動(dòng)進(jìn)樣閥時(shí)的壓力變化不大，自動(dòng)進(jìn)樣閥由于切換較慢，可能會(huì)造成壓力沖擊。
合理選擇分離柱。我們知道，選擇色譜分離柱主要根據(jù)兩點(diǎn)，一是根據(jù)待測(cè)組分的分子量的大?。欢歉鶕?jù)流動(dòng)相條件，包括PH值、離子強(qiáng)度和溶劑極性等。傳統(tǒng)硅膠基質(zhì)的鍵合相柱要求流動(dòng)相PH值在3-7之間，極端PH值(>8)的流動(dòng)相能溶解硅膠，使鍵合相流失。而目前利用先進(jìn)的雜化顆粒技術(shù)研制的高純硅膠顆粒填料(如Waters公司的XTerra色譜柱)，集硅膠和多孔聚合物填料的優(yōu)點(diǎn)為一體，使有機(jī)硅烷單元取代了相當(dāng)一部分占據(jù)顆粒內(nèi)部和表面位置的硅羥基，使這種新型填料具有分辨率高、穩(wěn)定性強(qiáng)、PH范圍寬(1-12)的優(yōu)勢(shì)，其性能突破了傳統(tǒng)高效液相色譜柱的極限。所以一定要根據(jù)分析的對(duì)象、流動(dòng)相的條件選擇合適的分離柱，茫然時(shí)可向公司的技術(shù)人員咨詢。
定期沖洗分離柱。每次分析工作結(jié)束時(shí)，沖洗完緩沖鹽后，最后要過度到用強(qiáng)溶劑沖洗柱子，如可用色譜純甲醇、乙腈沖洗反相C18柱，目的是沖去吸附在柱上的強(qiáng)保留組分。如果用甲醇/水為流動(dòng)相也應(yīng)這樣沖洗柱子，在一定程度上可恢復(fù)柱效。
1、流動(dòng)相的抽濾要求
色譜純?cè)噭握麴s水，緩沖鹽一定要過濾。
2、吸濾頭
特殊情況下可拆下濾頭抽取以判斷其中是否堵塞；亦可用注射器吸取流動(dòng)相通過吸濾頭打出以判斷其是否堵塞。若有堵塞情況可用異丙醇超聲波清洗；清洗不成功則需要更換。
3、單向閥
如遇到泵壓不穩(wěn)或流動(dòng)相不能抽取，則可能是單向閥出現(xiàn)問題，卸下用異丙醇超聲波清洗，清洗時(shí)須按其安裝的反相放置在小燒杯中，切記不可與安裝方向倒置超洗！
4、泵頭
泵頭漏液或出現(xiàn)其它故障一般要申請(qǐng)維修(如漏液，或更換柱塞桿及其密封墊等)。
5、過濾片
當(dāng)色譜峰出現(xiàn)異常情況時(shí)，有可能是此部件被污染，拆下用異丙醇超洗或更換過濾墊片。
6、排液閥
此處不能完全密封或漏液時(shí)一般是其中的墊片污染或磨損，可卸下后取出其墊片用異丙醇超聲波清洗或更換墊圈。
7、手動(dòng)進(jìn)樣器
平時(shí)應(yīng)注意用二次蒸餾水和甲醇在裝載狀態(tài)及進(jìn)樣分析狀態(tài)清洗；如出現(xiàn)漏液現(xiàn)象，原因極可能為轉(zhuǎn)子密封墊磨損或污染，一般須申請(qǐng)維修或更換配件。
8、流通池
在色譜峰不正常時(shí)可能是此部件被污染可拆卸后取出其中的墊片用異丙醇超洗(可根據(jù)說明書進(jìn)行操作或申請(qǐng)維修)。
9、工作站
出現(xiàn)死機(jī)可重啟計(jì)算機(jī)；不正常運(yùn)行時(shí)，首先可更換電腦測(cè)試其硬件故障；或在本機(jī)上重新插撥接口、重新安裝軟件。
高效液相色譜和氣相色譜在基本理論方面沒有顯著不同，它們之間的重大差別在于作為流動(dòng)相的液體與氣體之間的性質(zhì)的差別。
高效液相色譜分析原理：
一、高效液相色譜分析的流程：由泵將儲(chǔ)液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng)，然后輸出，經(jīng)流量與壓力測(cè)量之后，導(dǎo)入進(jìn)樣器。被測(cè)物由進(jìn)樣器注入，并隨流動(dòng)相通過色譜柱，在柱上進(jìn)行分離后進(jìn)入檢測(cè)器，檢測(cè)信號(hào)由數(shù)據(jù)處理設(shè)備采集與處理，并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到復(fù)雜的混合物分離極性范圍比較寬、還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似，不同的是氣相色譜改變溫度，而HPLC改變的是流動(dòng)相極性，使樣品各組分在較佳條件下得以分離。
二、高效液相色譜的分離過程：同其他色譜過程一樣，HPLC也是溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行的一種連續(xù)多次交換過程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。
二、高效液相色譜的分離過程：同其他色譜過程一樣，HPLC也是溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行的一種連續(xù)多次交換過程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。
開始樣品加在柱頭上，假設(shè)樣品中含有3個(gè)組分，A、B和C，隨流動(dòng)相一起進(jìn)入色譜柱，開始在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行分配。分配系數(shù)小的組分A不易被固定相阻留，較早地流出色譜柱。分配系數(shù)大的組分C在固定相上滯留時(shí)間長，較晚流出色譜柱。組分B的分配系數(shù)介于A，C之間，第二個(gè)流出色譜柱。若一個(gè)含有多個(gè)組分的混合物進(jìn)入系統(tǒng)，則混合物中各組分按其在兩相間分配系數(shù)的不同先后流出色譜柱，達(dá)到分離之目的。
不同組分在色譜過程中的分離情況，首先取決于各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附能力、親和力等是否有差異，這是熱力學(xué)平衡問題，也是分離的首要條件。其次，當(dāng)不同組分在色譜柱中運(yùn)動(dòng)時(shí)，譜帶隨柱長展寬，分離情況與兩相之間的擴(kuò)散系數(shù)、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動(dòng)相的流速等有關(guān)。所以分離最終效果則是熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)兩方面的綜合效益。
449717568
