因為含維生素A原料中常?；煊性S多雜質(zhì)，包括異構(gòu)體，氧化降解產(chǎn)物，合成中間體，副產(chǎn)物等有關(guān)物質(zhì)，且含有稀釋用油，這些雜質(zhì)在紫外區(qū)也有吸收，導(dǎo)致在維生素A最大吸收波長處測得的吸光度并不是維生素A獨有的吸收，為了消除其他物質(zhì)引起的誤差，所以采用三點校正法。
三點波長的選擇原則：一點選在維生素A的最大吸收波長處，其他的兩點各在這一波長兩側(cè)選一點。這兩點有兩種選擇方法，第一種是等波長差法，即最大吸收波長為328nm，左側(cè)一點為316nm，右側(cè)一點為340nm.這是10版藥典規(guī)定測定維生素A醋酸酯的方法。第二種方法是等吸收比法，即左右兩波長處的吸光度相等等于最大吸收波長處吸光度的七分之六。10版藥典規(guī)定測定維生素A醇時用此方法。
1．原理
維生素A的異丙醇溶液在325 nm波長下有最大吸收峰，其吸光度與維生素A的含量成正比。本法的靈敏度較比色法高，可測定維生素A含量低于5?g／g的樣品。主要缺點是在維生素A最大吸收波長325 nm附近許多其他化合物也有吸收，干擾測定，故本法適用于透明魚油，維生素A的濃縮物等純度較高的樣品。對于一般樣品，測定前必須先將脂肪抽提出來進(jìn)行皂化，萃取其不皂化部分，再經(jīng)柱層析除去干擾物。
2．儀器
紫外分光光度計; UV-1100;UV-1200。
3．試劑
①異丙醇。
?、诰S生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取1 g相當(dāng)于50 000國際單位維生素A的濃魚肝油0．1000 g，加異丙醇溶解，定容至125 mL。此溶液1 mL相當(dāng)于40國際單位(即40 IU．mL-1)。
4.測定步驟
①標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別取維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液(40 IU·mL-1)O．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、4.0 mL，于10 mL棕色容量瓶中，用異丙醇定容。以空白液調(diào)儀器零點，于紫外分光光度計上在325 nm波長下分別測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
?、跇悠窚y定：稱取適量樣品，按照三氯化銻比色法進(jìn)行皂化、提取、洗滌、濃縮、蒸發(fā)醚層后，迅速用異丙醇溶解并移人50 mL容量瓶中，用異丙醇定容，于紫外分光光度計325nm處測定其吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相當(dāng)?shù)木S生素A含量。
5．計算X=[(c*V)/m]*100
式中：
X——樣品維生素A的含量，IU·(100 g) -1；
c——由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的維生素A含量，IU·mL-1；
V——樣品的異丙醇溶液體積，mL；
m——樣品質(zhì)量，g。
為何不直接以紫外可見分光光度法測定維生素A的含量,而要采用較為繁瑣的三點校正法
牛胸腺DNA 鈉鹽溶液（pH = 7.0）ε（ρ）= 6 600,DNA 含磷量9.2%,含1μg/mL DNA 鈉鹽溶液光密度0.020.RNA 溶液（pH = 7.0）ε（ρ）= 7 700~7 800,RNA 含磷量9.5%,含1μg /mL RNA 溶液光密度0.022~0.024.采用紫外光光度測定核酸含量,通規(guī)定：260nm 波,濃度1μg/mL DNA 溶液其光密度0.020,濃度1μg/mL RNA 溶液其光密度0.024.,測定未知濃度DNA （RNA）溶液光密度OD260nm,即計算測其核酸含量.該簡單、快速、靈敏度高,核酸3μg／mL 含量即測.于含微量蛋白質(zhì)核苷酸等吸收紫外光物質(zhì)核酸品,測定誤差較,若品內(nèi)混雜量述吸收紫外光物質(zhì),測定誤差較,應(yīng)設(shè)事先除.
由于降解或水解作用,核酸光密度增高約40％,眾所周知增色效應(yīng)（hyperchromic effect）.核酸,氫鍵π-鍵相互作用改變堿基共振行.,核酸光密度低于構(gòu)核苷酸光密度,該現(xiàn)象稱減色效應(yīng)（hypochromic effect）.
紫外分光光度計就是根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜研究物質(zhì)的成分、結(jié)構(gòu)和物質(zhì)間相互作用的有效手段。紫外分光光度計可以在紫外可見光區(qū)任意選擇不同波長的光。物質(zhì)的吸收光譜就是物質(zhì)中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波長的光能量，相應(yīng)地發(fā)生了分子振動能級躍遷和電子能級躍遷的結(jié)果。由于各種物質(zhì)具有各自不同的分子 、原子和不同的分子空間結(jié)構(gòu)，其吸收光能量的情況也就不會相同，因此，每種物質(zhì)就有其特有的、固定的吸收光譜曲線，可根據(jù)吸收光譜上的某些特征波長處的吸光度的高低判別或測定該物質(zhì)的含量。
紫外分光光度計的操作要點：
啟動儀器之前，一定要把樣品室內(nèi)存放的防潮劑拿出，儀器進(jìn)行正常運轉(zhuǎn)檢查的時候，千萬不能開啟樣品室蓋；要求比色皿當(dāng)中的液體占總體積的66%-80%較佳，千萬不能讓液體太多，以致于液體外泄腐蝕儀器；正常檢測的時候，需要保證比色皿干凈，內(nèi)壁上液滴需要使用專業(yè)的紙進(jìn)行擦拭，千萬不能使用手進(jìn)行直接的擦拭，容易對使用人員的手造成傷害，相信沒有人希望這樣的事情發(fā)生。
在正常運轉(zhuǎn)的時候，嚴(yán)禁把液體溶劑放置于儀器的表層上，如果出現(xiàn)液體外泄的情況，一定要保證進(jìn)行及時的清潔處理。當(dāng)檢測完畢之后，需要及時將比色皿內(nèi)的液體處理掉，使用蒸餾水將其清理干凈，同時倒置進(jìn)行晾干處理。最后需要將儀器的電源關(guān)閉，把防潮劑放入到樣品室內(nèi)，做好防塵處理，等到管理人員同意方可離去。
紫外分光光度計的日常維護(hù)：
一、溫度和濕度是影響儀器性能的重要因素。他們可以引起機械部件的銹蝕，使金屬鏡面的光潔度下降，引起儀器機械部分的誤差或性能下降；造成光學(xué)部件如光柵、反射鏡、聚焦鏡等的鋁膜銹蝕，產(chǎn)生光能不足、雜散光、噪聲等，甚至儀器停止工作，從而影響儀器壽命。維護(hù)保養(yǎng)時應(yīng)定期加以校正。應(yīng)具備四季恒濕的儀器室，配置恒溫設(shè)備，特別是地處南方地區(qū)的實驗室。
二、環(huán)境中的塵埃和腐蝕性氣體亦可以影響機械系統(tǒng)的靈活性、降低各種限位開關(guān)、按鍵、光電偶合器的可靠性，也是造成必須學(xué)部件鋁膜銹蝕的原因之一。因此必須定期清潔，保障環(huán)境和儀器室內(nèi)衛(wèi)生條件，防塵。
三、儀器使用一定周期后，內(nèi)部會積累一定量的塵埃，可以由維修工程師或在工程師指導(dǎo)下定期開啟儀器外罩對內(nèi)部進(jìn)行除塵工作，同時將各發(fā)熱元件的散熱器重新緊固，對光學(xué)盒的密封窗口進(jìn)行清潔，必要時對光路進(jìn)行校準(zhǔn)，對機械部分進(jìn)行清潔和必要的潤滑，最后，恢復(fù)原狀，再進(jìn)行一些必要的檢測、調(diào)校與記錄。
紫外分光光度計應(yīng)用范圍包括市政和工業(yè)廢水，飲用水，加工過程用水，地表水，冷卻水和鍋爐補給水等。
是實驗室普及率最高的一種光譜儀器了，由于靈敏度高、選擇性好、準(zhǔn)確度高、適用濃度范圍廣，重要是分析成本低、操作簡便、快速得到廣泛的應(yīng)用，長期在分析領(lǐng)域扮演很重要的角色。但是常常會聽某些同學(xué)為啥時候更換光源而煩惱，每次數(shù)據(jù)有差別，都覺得是光源惹得禍。
紫外分光光度計信號部分：
（1）紫外分光光度計樣品信號重現(xiàn)性不良；
原因：排除儀器本身的原因外，最大的可能是樣品溶液不均勻所致；在簡易的單光束儀器中，樣品池架一般為推拉式的，有時重復(fù)推拉不在同一個位置上；
檢查：更換一種穩(wěn)定的試樣判定；
解決辦法：采取正確的試樣配置手段；修理推拉式樣品架的定位碰珠；
（2）紫外分光光度計做基線掃描或樣品掃描時，基線或信號有一個大的負(fù)脈沖；
原因：掃描速度設(shè)置得過快，信號在讀取時，誤將濾光片或光源鏡的切換當(dāng)做信號讀取了；
檢查：改變掃描速度；
（3）紫外分光光度計做基線掃描或樣品掃描時，基線或信號有一個長時間段的負(fù)值或滿屏大噪聲；
原因：濾光片飼服電機“失步”，造成檔位錯位，國產(chǎn)電機尤甚；
檢查：重新開機有可能回復(fù)，或打開單色器對照波長與濾光片的相對位置來檢查（注意：打開單色器時要保護(hù)檢測器不被強光刺激）；
解決辦法：更換飼服電機；
（4）紫外分光光度計樣品出峰位置不對；
原因：波長傳動機構(gòu)產(chǎn)生位移；
檢查：通過氘燈的656.1nm的特征譜線來判斷波長是否準(zhǔn)確；
解決辦法：對于高檔儀器而言處理手段相對簡單，使用儀器固有的自動校正功能即可；而對于相對簡單的儀器，這種調(diào)整則需要專業(yè)人員來進(jìn)行了；
（5）紫外分光光度計信號的分辨率不夠，具體表現(xiàn)是：本應(yīng)疊加在某一大峰上的小峰無法觀察到；
原因：狹縫設(shè)置過窄而掃描速度過快，造成檢測器響應(yīng)速度跟不上，從而失去應(yīng)測到的信號；按常理，一定的狹縫寬度要對應(yīng)一定范圍的掃描速度；或者狹縫設(shè)置得過寬，使儀器的分辨率下降，將小峰融合在大峰里了。
檢查：放慢掃描速度看一看或?qū)ⅹM縫設(shè)窄；
解決辦法：將掃描速度、狹縫寬窄、時間常數(shù)三者擬合成一個優(yōu)化的條件；
（6）當(dāng)紫外分光光度計波長固定在某個波長下時，吸光值信號上下擺動，特別是測量模式轉(zhuǎn)換為按鍵開關(guān)式的簡易儀器；
原因：開關(guān)觸點因長期氧化所致造成接觸不良；
檢查：用手加重力量按琴鍵時，吸光值隨之變化；
解決辦法：用金屬活化劑清洗按鍵觸點即可；
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