色譜柱是高效液相色譜的心臟,在高效液相色譜儀的使用中,保持色譜柱的柱效、容量和滲透性,延長柱子的使用壽命非常重要。色譜柱壓升高一般是由于柱床內產生了雜質,造成流體阻力加大所致。淺析其原因,大致有以下幾方面:
流動相的前處理
雜質堵塞色譜柱進口濾片,導致壓力升高。這往往是由于流動相沒有過濾,或雖已過濾但過濾不徹底,使固體雜質滯留于濾板上所造成的。
樣品的沉淀
當溶解樣品的溶劑與流動相不一致時,樣品進入色譜柱,有時可能因溶解度降低而沉淀出來,造成壓力升高。
晶體的析出
使用含有緩沖液的流動相時,緩沖液中的無機鹽可能會殘留在體系之中,它們會因在新流動相中的溶解度降低而析出,造成流體阻力加大、壓力升高。
細菌或霉菌孳生
霉菌在流動相中、管路中或柱子進口處繁殖、生長堵塞濾板,導致壓力升高。所以在使用磷酸鹽緩沖液時一般要現配現用。
溶質吸附
當溶質在柱子上有較強的吸附,且所用的流動相難以將它們洗脫時,累積的未洗脫溶質也會造成阻力增大和壓力升高。
流動相更換過度較快
當改變流動相體系時,不徹底的更換使不同性質、互不混溶的流動相存在于同一個體系之中,也會造成壓力升高。
壓力脈沖
運行過程中,有時會產生系統(tǒng)內壓力的突然升降。如此所形成的壓力脈沖會造成多孔填料的崩壞和柱床結構的微小變化,填料微屑的長期積累也可能會使柱床阻力增大,造成壓力升高。
在日常分離分析工作中,色譜柱的正確使用和維護十分重要,色譜柱使用是否得當,直接影響色譜柱的壽命,稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操縱過程中,需要留意下列題目,以維護色譜柱。
(1)柱子在裝卸、更換時,動作要輕,接頭擰緊要適度。必須防止較強的機械振動,以免柱床產生空隙。
(2)假如儀器用來做常規(guī)分析,樣品種類有限,但分析次數多,則不妨為每一類常規(guī)分析配置一根專用柱,這樣有助于延長柱子的壽命。
(3)避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的忽然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況;柱壓的忽然升高或降低也會沖動柱內填料,因此在調節(jié)流速時應該緩慢進行,在閥進樣時閥的轉動不能過緩。
(4)應逐漸改變溶劑的組成,特別是反相色譜中,不應直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬?,反之亦然?/p>
(5)如使用柱溫控制裝置時,應留意在通人活動相后才能升溫。
(6)一般說來色譜柱不能反沖,只有生產者指明該柱可以反沖時,才可以反沖除往留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效。
(7)選擇使用適宜的活動相,以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一個預柱,分析柱是鍵合硅膠時,預柱為硅膠,可使活動相在進進分析柱之前預先被硅膠“飽和”,避免分析柱中的硅膠基質被溶解。
(8)避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注人柱內,需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一個保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經常更換。
(9)經常用強溶劑沖洗色譜柱,清除保存在柱內的雜質。在進行清洗時,對流路系統(tǒng)中活動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡,每種活動相的體積應是柱體積的20倍左右,即常規(guī)分析需要50-75mL。
(10)保存色譜柱時應將柱內布滿乙腈或甲醇,柱接頭要擰緊,防止溶劑揮發(fā)干燥。盡對禁止將緩沖溶液留在柱內靜置過夜或更長時間。
(11)色譜柱使用過程中,假如壓力升高,一種可能是燒結濾片被堵塞,這時應更換濾片或將其取出進行清洗;另一種可能是大分子進人柱內,使柱頭被污染;假如柱效降低或色譜峰變形,則可能柱頭出現塌陷,死體積增大。
色譜柱是色譜儀器中重要組成部分之一,它是分離不可缺少的一部分。因此不同的樣品分類,用到不同的色譜柱。
色譜柱可簡單分為以下幾類:
a、根據分離方式分為:
(1)正相色譜柱:SIL--磷脂、NH--糖、維生素E,CN--甾類激素。
(2)反相色譜柱:ODS(C18)、(C8CNTMSPheny1)低分子量化合物。
(3)離子交換色譜柱等。
b、根據所有的擔體材料分為三種:
(1)硅膠型:機械強度高,易制成小顆粒,理論塔板數高。
(2)聚合物型:在廣泛的PH值范圍內穩(wěn)定。
(3)羥基磷灰石型:對蛋白質等生物高分子樣品有特殊的選擇性。