色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對(duì)色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。
影響色譜柱性能的物理因素：
1、硅膠純度：硅膠純度和殘留金屬離子濃度，硅膠的雜質(zhì)會(huì)影響化合物的峰形，硅膠表面的金屬含量高會(huì)影響堿性化合物的峰形，易發(fā)生拖尾。
2、色譜柱尺寸填料床的長度和內(nèi)徑，增加色譜柱長度，可以在一定程度上提高柱效，但也會(huì)升高壓力和導(dǎo)致峰展寬；寬柱徑，提高載樣量，但也會(huì)增加橫向擴(kuò)散，同樣會(huì)導(dǎo)致峰展寬。窄柱徑可以節(jié)約溶劑，可減少橫向擴(kuò)散，但壓力較大，對(duì)系統(tǒng)要求較高。
3、顆粒形狀及粒徑球形顆粒柱效高、重現(xiàn)性好、柱床結(jié)構(gòu)均勻，不規(guī)則形柱床結(jié)構(gòu)不均勻、流動(dòng)相線速度不均勻，容易譜帶展寬；平均顆粒直徑，粒徑越小，柱效越高，柱壓也越高。粒徑分布越廣則柱效越低，壓力越大。
4、顆粒表面積：顆粒外表面和內(nèi)部孔表面的總和，以m2/g表示，相對(duì)而言高表面積對(duì)樣品具有較強(qiáng)的保留能力，更大的柱容量和分離度。而低表面積能更快達(dá)到平衡狀態(tài)，更適合梯度洗脫程序。
5、孔徑：顆粒的孔或腔的平均尺寸，范圍是80~300，大孔徑的填料顆?？梢匝娱L大分子溶質(zhì)在填料表面的滯留時(shí)間，改善分離，所以大孔徑填料適合分離大分子化合物或者水動(dòng)力體積較大的分子。
色譜柱的使用壽命，除了與所分析的樣品和流動(dòng)相及使用頻率有關(guān)系外，主要的是與日常的維護(hù)密切相關(guān)。色譜柱的使用壽命主要是柱效和柱壓兩個(gè)指標(biāo)來衡量，如果一支色譜柱柱效太低或柱壓太高，通常被認(rèn)為該色譜柱已經(jīng)結(jié)束。因此，延長色譜柱使用壽命的關(guān)鍵是，消除引起柱效下降和柱壓升高的因素。以下是色譜柱的維護(hù)方法：
一、流動(dòng)相的PH應(yīng)在使用的范圍內(nèi)
流動(dòng)相超過其PH范圍將會(huì)導(dǎo)致硅膠基質(zhì)流失和鍵合相碳鏈斷裂，使柱效下降，使用壽命變短。由于流動(dòng)相的PH控制不當(dāng)而對(duì)色譜柱造成的損害，通常很難是色譜柱恢復(fù)，因此必須認(rèn)真對(duì)待，嚴(yán)格控制流動(dòng)相的PH值。
二、去除樣品和流動(dòng)相中的固體顆粒
樣品和流動(dòng)相中含有的固體顆粒物質(zhì)會(huì)堵塞色譜柱篩板，篩板被堵住不僅會(huì)引起柱壓的升高，而且也會(huì)引起柱效下降，因?yàn)楹Y板的堵塞會(huì)引起液流不均，導(dǎo)致色譜峰型拖尾、變寬，從而使柱效下降。因此，建議使用超純水和色譜純?cè)噭?，在分析樣品前?duì)樣品進(jìn)行針筒過濾，流動(dòng)相過0、45μm濾膜。
三、使用保護(hù)柱或在線過濾器
樣品和流動(dòng)相經(jīng)過濾后并不能完全消除固體顆粒物質(zhì)，因?yàn)楸玫哪p、密封圈和管路的老化也會(huì)產(chǎn)生固體顆粒物質(zhì)，這些固體顆粒被流動(dòng)相帶入色譜柱，堵塞篩板，導(dǎo)致柱壓升高、柱效下降。保護(hù)柱和在線過濾器上都有篩板，其孔徑與色譜柱孔徑相同，因此可以阻止固體顆粒物質(zhì)到達(dá)色譜柱，有效防止色譜柱篩板的堵塞。由于柱壓升高在分析故障中占很大比例，因此，除對(duì)樣品和流動(dòng)相進(jìn)行過濾外，建議您在色譜柱進(jìn)樣端加上保護(hù)柱或在線過濾器。
如果色譜柱柱壓升高是由于進(jìn)樣端篩板被堵引起的，可選擇以下方式進(jìn)行補(bǔ)救：
1、先在色譜柱前加上保護(hù)柱或在線過濾器，然后用甲醇、水=20/80ml/min反向沖色譜柱180min、
2、先在色譜柱進(jìn)樣端加上保護(hù)柱或在線過濾器，然后反向使用。
四、正確使用緩沖鹽
緩沖鹽通常易溶于水，難溶于有機(jī)溶劑，因此緩沖鹽使用不當(dāng)會(huì)使其析出，堵塞填料基質(zhì)上的微孔和顆粒間的空隙，使填料板結(jié)，柱壓上升；同時(shí)阻礙了基質(zhì)上鍵合的碳鏈自由舒展，使色譜柱的保留能力下降，柱效降低。緩沖鹽析出后，去除非常困難，因此，正確的使用緩沖鹽對(duì)延長色譜柱使用壽命非常重要。
正確使用緩沖鹽的目的是防止緩沖鹽析出，因此正確使用緩沖鹽的方法可歸結(jié)為一句話：使用前要過濾，使用后要沖洗。具體方法如下：
1、等度條件：使用緩沖鹽前和使用后需用過渡流動(dòng)相以1、0ml/min流速?zèng)_洗60min；使用后去除緩沖鹽的另一個(gè)方法是用過渡流動(dòng)相以0、2ml/min流速?zèng)_洗色譜柱過夜。
2、梯度條件：用含有緩沖鹽的流動(dòng)相跑梯度之前，用與初始流動(dòng)相組成相同的過渡流動(dòng)相以1、0ml/min流速?zèng)_洗60min，再用該過渡流動(dòng)相以1、0ml/min沖洗色譜柱120min。含緩沖鹽流動(dòng)相的梯度設(shè)定應(yīng)盡量平緩，以避免梯度過程中緩沖鹽析出。
注意：過渡流動(dòng)相是指有機(jī)相和水相的組成與分析流動(dòng)相相同，區(qū)別只是過渡流動(dòng)相不含緩沖鹽。
3、緩沖鹽析出的補(bǔ)救方法：
方案1：用甲醇/20/80以1、0ml/min流速35攝氏度條件下反向沖洗色譜柱120min
方案2：用甲醇/水=20/80以0、2ml/min流速反向沖洗色譜柱過夜。
五、防止強(qiáng)保留物質(zhì)在色譜柱上存留
強(qiáng)保留物質(zhì)和大分子化合物在色譜柱中累積，對(duì)樣品中的化合物產(chǎn)生額外的保留行為，不僅引起峰型變寬、拖尾，使柱效下降，同時(shí)也會(huì)引起保留時(shí)間的變化，累積到一定程度時(shí)還會(huì)導(dǎo)致柱壓升高。由于強(qiáng)保留物質(zhì)和大分子化合物對(duì)色譜分離的影響是一個(gè)累積效應(yīng)，需要一定的時(shí)間才會(huì)體現(xiàn)出來，但對(duì)許多藥品特別是復(fù)雜樣品而言，很難判斷其是否是含有強(qiáng)保留物質(zhì)，因此要防止強(qiáng)保留物質(zhì)的累積，需要在每天的日常維護(hù)中用純甲醇或乙氰清洗色譜柱。
1、流動(dòng)相
在以水溶液為流動(dòng)相時(shí),水溶液中的微生物例如細(xì)菌容易生長,當(dāng)用水溶液或有機(jī)酸緩沖液保護(hù)柱子時(shí),一些霉菌可能在色譜柱中滋生,堵塞固定相顆粒間的空隙。由于濕法填充技術(shù)的問世,目前普遍使用的色譜柱填料直徑一般都小于10um,流動(dòng)相中的顆粒雜質(zhì)很容易先沉積在柱頭然后慢慢堵塞柱子。流動(dòng)相的pH值對(duì)色譜柱也有影響,特別是對(duì)化學(xué)鍵合硅膠填料,水溶液的pH最適范圍在2~7.5之間,當(dāng)pH>8時(shí),硅膠會(huì)釋出生成絮狀物堵塞柱子,且難以復(fù)原,柱效很快降低,甚至完全失效。當(dāng)在緩沖液中加入有機(jī)溶劑例如甲醇或乙腈時(shí),鹽類的溶解度下降,會(huì)析出鹽沉淀,堵塞柱子。同時(shí)流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑和鹽會(huì)腐蝕色譜柱頭的篩板,產(chǎn)生柱頭凹陷。流動(dòng)相的極性對(duì)柱子也有一定影響,對(duì)于硅膠柱,甲醇、水、冰乙酸等極性較大物質(zhì)會(huì)破壞填料,反之,對(duì)于化學(xué)鍵合硅膠,極性小的物質(zhì)如正丁醇、二氯甲烷等也起同樣的作用。堿性溶液會(huì)破壞陽離子交換樹脂色譜柱,而酸性溶液容易損壞陰離子交換樹脂柱。
2、樣品和固定相
如果有少量或微量的樣品不能夠溶解在流動(dòng)相中,在通過固定相會(huì)堵塞柱子。樣品中的顆粒雜質(zhì)也會(huì)堵塞柱子。樣品組分例如糖、蛋白質(zhì)等通過柱子時(shí)會(huì)產(chǎn)生不可逆吸附,這樣固定相的活性點(diǎn)被覆蓋。樣品組分還會(huì)與固定相產(chǎn)生反應(yīng),尤其是對(duì)于氨基柱的影響較為嚴(yán)重,因?yàn)榘被着c酐、酮形成希夫(Schiff)縮合而減少活性點(diǎn),使保留時(shí)間縮短。色譜柱鍵合相基團(tuán)脫落、固定相分解和活性基團(tuán)變性以及會(huì)影響柱效和保留時(shí)間的顯著改變。大多數(shù)鍵合相都是通過硅氧硅鍵(Si-O-Si)連接在硅基質(zhì)上,形成帶有有機(jī)基團(tuán)的固定相Si-O-Si-R(R為CnH2n+1),硅氧硅鍵可能在水溶液中水解而斷裂,使鍵合基團(tuán)脫落。
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