當(dāng)色譜柱使用一段時(shí)間以后，柱內(nèi)由于各種原因，滯留了一些高沸點(diǎn)組分或氧化物等，除柱效有所下降外，還可能出現(xiàn)基線波動(dòng)或“鬼峰”。為了去除污染物，使柱效和基線恢復(fù)到原來(lái)的狀態(tài)，稱(chēng)為色譜柱的再生。色譜柱的再生和柱老化有一定區(qū)別和不同，它是柱在使用一段時(shí)間柱性能下降，經(jīng)處理后盡量恢復(fù)到原來(lái)性能的過(guò)程。
A、色譜柱在以下幾種情況必須再生處理
a.使一段時(shí)間，柱效明顯下降；
b.柱被污染，特別是在程序升溫時(shí)，基線漂移和噪聲超過(guò)容忍程度或出現(xiàn)“鬼峰”；
c.柱頭塌陷，柱床短路或斷位(在玻璃柱中容易發(fā)現(xiàn))，而出現(xiàn)尖峰或雙重峰；
d.峰形展寬，保留時(shí)間明顯變化；
e.待分離組分和固定相表面非特異性相互作用，引起保留時(shí)間較短的峰拖尾或出現(xiàn)雙峰；
B、毛細(xì)管柱再生的幾種方法
a.用載氣將色譜柱污染物沖洗出來(lái)；
b.將柱頭截去100mm 或更長(zhǎng)一些；
c.若使用交聯(lián)的色譜柱，可在儀器上反復(fù)注射溶劑進(jìn)行沖洗。常用的溶劑依次為丙酮、甲苯、乙醇、氯仿和二氯甲烷，每次可進(jìn)樣5～10μL；
d.交聯(lián)柱在儀器上沖洗無(wú)效時(shí)，可把柱拆下來(lái)用二氯甲烷或氯仿沖洗，溶劑用量視柱的污染程度而定，一般20mL 左右。
C、色譜柱再生前應(yīng)注意的問(wèn)題
當(dāng)分析出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，不能只考慮是柱問(wèn)題，而馬上進(jìn)行再生。除上述情況外，還應(yīng)考慮樣品處理、進(jìn)樣技術(shù)、操作有無(wú)失誤、數(shù)據(jù)處理參數(shù)有無(wú)改變等可能帶來(lái)的問(wèn)題。
a.襯管、預(yù)柱和檢測(cè)器被污染也會(huì)引起基線不穩(wěn)定、出現(xiàn)“鬼峰”或裂解峰；
b.新的注射墊也會(huì)引起基線漂移和出現(xiàn)“鬼峰”；
c.襯管密封欠佳、柱安裝死體積或檢測(cè)器固有特性也會(huì)引起較早出現(xiàn)峰的拖尾；
d.分析系統(tǒng)發(fā)生變化(如漏氣嚴(yán)重)也可能使保留時(shí)間突變；
e.峰變寬，除柱效下降外也可能由柱外效應(yīng)引起；
f.進(jìn)樣量太大也會(huì)引起峰變寬、拖尾或保留時(shí)間變短；
g.色譜柱長(zhǎng)時(shí)間樣品過(guò)載，保留時(shí)間也會(huì)變小等。
D、色譜柱再生時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題
1.如前所述和色譜柱老化一樣，不是溫度越高越好，時(shí)間越長(zhǎng)越好；建議不要使用長(zhǎng)時(shí)間烘烤的方法，來(lái)處理受到污染的色譜柱，因?yàn)楹婵緯r(shí)，溫度會(huì)把污染的殘留物變成不能溶解的物質(zhì)，再用溶劑清洗也無(wú)濟(jì)于事；
2.儀器在高靈敏度操作時(shí)，如：量程在1×10-11A/mV以下，痕量分析程序升溫過(guò)程中，溫度升到大于180℃后，基線明顯漂移是不可避免的；
3.不同類(lèi)型柱子，再生方法不同；
4.樣品種類(lèi)、組分、進(jìn)樣量不同或操作時(shí)間長(zhǎng)短不同，再生方法也不同；
5.儀器本身?xiàng)l件如：氣源種類(lèi)、純度、凈化條件、進(jìn)樣口結(jié)構(gòu)和操作檢測(cè)器不同，再生柱方法也有區(qū)別；
6.高分子量組分污染色譜柱后，高溫再生時(shí)間長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致固定相的老化；使用交聯(lián)或鍵合柱可以用溶劑漂洗再生，漂洗溶劑流動(dòng)方向一定要從柱出口注入。應(yīng)該注意，毛細(xì)管柱交聯(lián)鍵合率通常不到90%，因此會(huì)漂洗掉未化學(xué)結(jié)合的液相部分，所以保留時(shí)間和分離狀態(tài)會(huì)有所變化；
7.對(duì)于難揮發(fā)物，碳化物是不能通過(guò)再生除去，對(duì)于填充柱可以使用帶襯管氣化室進(jìn)樣器，對(duì)于毛細(xì)管可通過(guò)把柱入口切去30～50cm的方法除去污物段。有條件的可以使用預(yù)柱，把不揮發(fā)的有機(jī)物、無(wú)機(jī)物和顆粒材料阻留在預(yù)柱中，需要時(shí)更換預(yù)柱；
8.在某些情況下，色譜柱要在溫度極限附近使用，這時(shí)基線漂移和大噪聲已不可避免，柱的再生要求只能視情況而定；
9.不是所有色譜柱通過(guò)再生均能恢復(fù)原來(lái)性能。
一﹑去除樣品和流動(dòng)相中的固體顆粒
樣品和流動(dòng)相中含有的固體顆粒物質(zhì)會(huì)堵塞色譜柱篩板，篩板被堵住不僅會(huì)引起柱壓的升高，而且也會(huì)引起柱效下降，因?yàn)楹Y板的堵塞會(huì)引起液流不均，導(dǎo)致色譜峰型拖尾、變寬，從而使柱效下降。因此，建議使用超純水和色譜純?cè)噭诜治鰳悠非皩?duì)樣品進(jìn)行針筒過(guò)濾，流動(dòng)相過(guò)0.45μm濾膜。
二﹑流動(dòng)相的PH應(yīng)在使用的范圍內(nèi)
由于流動(dòng)相的PH 控制不當(dāng)而對(duì)色譜柱造成的損害，通常很難使色譜柱恢復(fù)，因此必須認(rèn)真對(duì)待，嚴(yán)格控制流動(dòng)相的PH值。
三、使用保護(hù)柱或在線過(guò)濾器
樣品和流動(dòng)相經(jīng)過(guò)濾后并不能完全消除固體顆粒物質(zhì)，因?yàn)楸玫哪p、密封圈和管路的老化也會(huì)產(chǎn)生固體顆粒物質(zhì)，這些固體顆粒被流動(dòng)相帶入色譜柱，堵塞篩板，導(dǎo)致柱壓升高、柱效下降。保護(hù)柱和在線過(guò)濾器上都有篩板，其孔徑與色譜柱孔徑相同，因此可以阻止固體顆粒物質(zhì)到達(dá)色譜柱，有效防止色譜柱篩板的堵塞。由于柱壓升高在分析故障中占很大比例，因此，除對(duì)樣品和流動(dòng)相進(jìn)行過(guò)濾外，建議您在色譜柱進(jìn)樣端加上保護(hù)柱或在線過(guò)濾器。
如果色譜柱柱壓升高是由于進(jìn)樣端篩板被堵引起的，可選擇一下方式進(jìn)行補(bǔ)救：
1、先在色譜柱前加上保護(hù)柱或在線過(guò)濾器，然后用甲醇、水=20/80ml/min反向沖色譜柱180min。
2、先在色譜柱進(jìn)樣端加上保護(hù)柱或在線過(guò)濾器，然后反向使用。
四﹑防止強(qiáng)保留物質(zhì)在色譜柱上存留
強(qiáng)保留物質(zhì)和大分子化合物在色譜柱中累積，對(duì)樣品中的化合物產(chǎn)生額外的保留行為，不僅引起峰型變寬、拖尾，使柱效下降，同時(shí)也會(huì)引起保留時(shí)間的變化，累積到一定程度時(shí)還會(huì)導(dǎo)致柱壓升高。由于強(qiáng)保留物質(zhì)和大分子化合物對(duì)色譜分離的影響是一個(gè)累積效應(yīng)，需要一定的時(shí)間才會(huì)體現(xiàn)出來(lái)，但對(duì)許多藥品特別是復(fù)雜樣品而言，很難判斷其是否是含有強(qiáng)保留物質(zhì)，因此要防止強(qiáng)保留物質(zhì)的累積，需要在每天的日常維護(hù)中用純甲醇或乙氰清洗色譜柱。
五﹑正確使用緩沖鹽
緩沖鹽通常易溶于水，難溶于有機(jī)溶劑，因此緩沖鹽使用不當(dāng)會(huì)使其析出，堵塞填料基質(zhì)上的微孔和顆粒間的空隙，使填料板結(jié)，柱壓上升；同時(shí)阻礙了基質(zhì)上鍵合的碳鏈自由舒展，使色譜柱的保留能力下降，柱效降低。緩沖鹽析出后，去除非常困難，因此，正確的使用緩沖鹽對(duì)延長(zhǎng)色譜柱使用壽命非常重要。
色譜柱的利用壽命，除了與所分析的樣品和流動(dòng)相及利用頻率有關(guān)系外，主要的是與日常的委會(huì)密切相關(guān)。為延長(zhǎng)色譜柱的利用壽命，維護(hù)您的利益，請(qǐng)仔細(xì)閱讀此部分。 色譜柱的利用壽命主要是分局柱效和柱壓兩個(gè)指標(biāo)來(lái)衡量，假設(shè)一支色譜柱柱效太低或柱壓太高，通常被認(rèn)為該色譜柱已經(jīng)結(jié)束。因此，延長(zhǎng)色譜柱利用壽命的關(guān)鍵是，消除引起柱效下降和柱壓升高的因素。
以下是色譜柱的日常維護(hù)點(diǎn)子：
1.流動(dòng)相的PH應(yīng)在利用的范圍內(nèi)反相色譜柱由于填料中存在Si-C和Si-O鍵，流動(dòng)相超過(guò)其PH范圍將會(huì)導(dǎo)致硅膠基質(zhì)流失和鍵合相碳鏈斷裂，使柱效下降，利用壽命變短。由于流動(dòng)相的PH 控制欠妥而對(duì)色譜柱造成的損害，通常很難是色譜柱恢復(fù)，因此必須認(rèn)真對(duì)待，嚴(yán)格控制流動(dòng)相的PH值。
2.去除樣品和流動(dòng)相中的固體顆粒 樣品和流動(dòng)相中含有的固體顆粒物質(zhì)會(huì)堵塞色譜柱篩板，篩板被堵住不僅會(huì)引起柱壓的升高，而且也會(huì)引起柱效下降，因?yàn)楹Y板的堵塞會(huì)引起液流不均，導(dǎo)致色譜峰型拖尾、變寬，從而使柱效下降。因此，建議利用超純水和色譜純?cè)噭?，在分析樣品前?duì)樣品進(jìn)行針筒過(guò)濾，流動(dòng)相過(guò)0.45μm濾膜。
3.利用維護(hù)柱或在線過(guò)濾器 樣品和流動(dòng)相經(jīng)過(guò)濾后并不能完全消除固體顆粒物質(zhì)，因?yàn)楸玫哪p、密封圈和管路的老化也會(huì)產(chǎn)生固體顆粒物質(zhì)，這些固體顆粒被流動(dòng)相帶入色譜柱，堵塞篩板，導(dǎo)致柱壓升高、柱效下降。維護(hù)柱和在線過(guò)濾器上都有篩板，其孔徑與色譜柱孔徑相同，因此能夠阻止固體顆粒物質(zhì)到達(dá)色譜柱，有效防止色譜柱篩板的堵塞。由于柱壓升高在分析故障中占很大比例，因此，除對(duì)樣品和流動(dòng)相進(jìn)行過(guò)濾外，建議您在色譜柱進(jìn)樣端加上維護(hù)柱或在線過(guò)濾器。 假設(shè)確認(rèn)色譜柱柱壓升高是由于進(jìn)樣端篩板被堵引起的，可選擇以下方式進(jìn)行補(bǔ)救：
先在色譜柱前加上維護(hù)柱或在線過(guò)濾器，然后用甲醇、水=20/80ml/min反向沖色譜柱180min。
先在色譜柱進(jìn)樣端加上維護(hù)柱或在線過(guò)濾器，然后反向利用。
色譜柱參數(shù)
物理性質(zhì)
柱長(zhǎng)，內(nèi)徑，如250*4.6mm。一般柱長(zhǎng)在2—250mm，柱越長(zhǎng)，分離度越高，但柱壓更高，分離所需時(shí)間更長(zhǎng);但分離度與理論塔板數(shù)的平方根成正比，所以一昧增加柱長(zhǎng)并不是較為有效的分離手段，一般情況下，150mm、5um的填料可以提供足夠的塔板數(shù)。
粒徑，影響色譜分離度。粒徑越小，分離越快，柱效越高，但柱壓力越高，柱容易被污染，導(dǎo)致柱壽命降低。常見(jiàn)分析柱通常使用5um填料，復(fù)雜的多組分樣品分離一般使用3.5um粒徑，更大內(nèi)徑的制備色譜柱通常使用更大的粒徑。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選用更小的粒度的填料是很有用的。3.5um填料填充柱的柱效比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%;然而，3.5um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍，因此如何選擇填料粒徑需要根據(jù)現(xiàn)實(shí)情況而定。
孔徑，60A，120A，300A等?？讖叫?，則含孔率高，比表面積大，載碳量高;色譜柱填料孔徑大小需和分子大小相匹配，保證分子自由進(jìn)出填料孔并與孔內(nèi)表面的鍵合相進(jìn)行分離分配，通常要求孔徑直徑是分子直徑的3倍以上，一般小分子使用80—120A，大分子使用300A。
顆粒形狀，一般有球形和不規(guī)則形，當(dāng)使用黏度較大的流動(dòng)相時(shí)，球形顆?？梢越档椭鶋?，延長(zhǎng)色譜柱壽命。
苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂，化學(xué)穩(wěn)定，應(yīng)用pH范圍寬，具有更強(qiáng)的疏水性，對(duì)蛋白質(zhì)等樣品分離效果較好;但強(qiáng)度較小，有機(jī)溶劑可能導(dǎo)致聚合物溶脹而受損，批次重復(fù)性較差，商品化色譜柱不多，一般價(jià)格較貴。
載碳量：基質(zhì)表面鍵合相的比例，載碳量高，則保留增加，適合分析非極性化合物。
鍵合相：鍵合試劑不同，對(duì)化合物的選擇性不同，一般長(zhǎng)鏈的烷基鍵合相(C18 C8)比短鏈的(C4 C3)穩(wěn)定;非極性的鍵合相比極性的鍵合相(-NH2)穩(wěn)定。
封端：用短鏈將裸露的硅羥基鍵合后封閉起來(lái)，以減少殘留的硅醇基，減輕待測(cè)組分與酸性硅羥基反應(yīng)而引起的色譜峰拖尾現(xiàn)象。尤其對(duì)于極性樣品而言，未封端處理的色譜柱分離效果較差。
現(xiàn)在商品化的液相色譜柱琳瑯滿目，根據(jù)色譜柱的參數(shù)可以給我們提供一個(gè)初步的選擇，但由于各個(gè)儀器廠商的填料技術(shù)和鍵合技術(shù)都有差異，即使都是C18柱，同一品牌不同系列都有不同的功能，有能耐受低pH值的、有耐高溫的、有適合堿性樣品的等等。所以在選擇色譜柱前要好好研究色譜柱參數(shù)，仔細(xì)閱讀色譜柱說(shuō)明書(shū)，才能找到合適的色譜柱和適宜的分離方法。
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