色譜柱在使用中常見的問(wèn)題就是柱壓升高，如果柱壓是在長(zhǎng)時(shí)間使用過(guò)程中緩慢增加，屬于正?，F(xiàn)象。但柱壓在使用過(guò)程中突然升高（系統(tǒng)管路堵塞及壓力傳感器故障除外），以下列舉了部分常見原因及解決辦法：
?。?）色譜柱頭的過(guò)濾篩板堵塞或污染；
解決方法：如確定是色譜柱頭的過(guò)濾篩板被污染，可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力，或者卸下色譜柱頭，將其放在10％的稀硝酸內(nèi)超聲清洗10分鐘，后再用純水超聲10分鐘，重新裝入色譜柱。
（2）色譜柱頭的填料被樣品污染；
解決方法：如確定色譜柱頭的填料被污染，將柱頭螺絲卸下，挖出柱內(nèi)前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔細(xì)修復(fù)后，重新安裝上柱頭螺絲。
（3）色譜柱內(nèi)緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機(jī)溶劑，形成結(jié)晶析出；解決方法：如確定定是鹽結(jié)晶，用10%的甲醇/水沖洗色譜柱使柱內(nèi)鹽全部溶解，再換高濃度甲醇。
?。?）流動(dòng)相PH值過(guò)大或過(guò)小使固定相結(jié)構(gòu)破壞或溶解。解決方法：如果因PH值使用不當(dāng)，很難恢復(fù)。
色譜柱的安裝：
1)將液相色譜裝置中的流動(dòng)相完全置換后再連接色譜柱，并完全排出流路內(nèi)的空氣。
裝置內(nèi)的液體和所使用的流動(dòng)相不能相溶的情況下，使用雙方都能相溶的液體做過(guò)渡。比如從水置換到氯仿的情況，就需要使用丙酮做過(guò)渡，才能完全置換。
將鹽溶液置換成有機(jī)溶劑的時(shí)候，需要通過(guò)純水、丙酮的順序來(lái)進(jìn)行置換。相反，從有機(jī)溶劑轉(zhuǎn)換成鹽溶液的情況下，需要通過(guò)丙酮、純水的順序置換。
不僅僅是泵，流動(dòng)相流動(dòng)的所有流路都必須進(jìn)行置換。例如，注入樣品的情況，軟管內(nèi)的液體也需要置換。另外，如果使用壓力計(jì)等別的軟管的情況，取下來(lái)的管子也必須由流動(dòng)相洗凈后才能繼續(xù)使用。
2)色譜柱保存方法不對(duì)或者長(zhǎng)期不使用的情況下，色譜柱的出入口可能會(huì)有空氣殘留。這種情況下，必須先把空氣完全排出后才連接到裝置中。
避免快速加熱，加熱溫度不要超過(guò)色譜柱的最高負(fù)荷溫度。
把柱子入口側(cè)的螺栓打開，然后加溫(一般加溫到手心感到溫暖的程度就足夠了)，等液體滿出來(lái)以后接到裝置上。然后，打開出口處的螺栓，用泵送液，等確認(rèn)出口處有液體流出后，連接到裝置中。這樣操作，就算后面再連接一根色譜柱也能完全除去空氣。
3)在泵運(yùn)作的時(shí)候連接色譜柱。確保能讓流動(dòng)相按照色譜柱上箭頭的方向流動(dòng)的狀態(tài)連接色譜柱。
4)色譜柱加溫使用的時(shí)候，先用0.2～0.3mL/min的低流量一邊送液一邊升溫。達(dá)到所定溫度后，再漸漸的增加流量至測(cè)定流量。
5)色譜柱需要安定時(shí)間。連接到裝置中立即進(jìn)行測(cè)試的情況下，第一次很難得到好的分析結(jié)果。
影響色譜柱壽命和其它問(wèn)題的因素很多，而有些因素是操作者很難控制的，如果被分析的樣品(如分析生物樣品)，怎么凈化樣品也是“臟"的，對(duì)于色譜柱的影響是非常大的。然而采取下列措施后，在多數(shù)情況下總能夠人為地減少色譜柱上故障，達(dá)到延長(zhǎng)壽命的目的。
色譜柱預(yù)防及維護(hù)—避免高壓沖擊
一般色譜柱都能經(jīng)得起高壓，但經(jīng)不起突然變化的高壓沖擊。引起高壓突然沖擊，主要是因樣品閥的緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)、泵起動(dòng)快、柱切換操作等。轉(zhuǎn)動(dòng)六通進(jìn)樣閥時(shí)從泵到柱的液流會(huì)瞬時(shí)切斷。在閥的泵側(cè)壓力升高，在閥的柱側(cè)壓力降低(變化超過(guò)20%)。閥轉(zhuǎn)到底后壓力突然沖擊一下恢復(fù)正常。手動(dòng)進(jìn)樣閥的變化不大，自動(dòng)進(jìn)樣閥比較慢，可能造成壓力沖擊，可用氦氣代替空氣驅(qū)動(dòng)進(jìn)樣閥。因氮壓縮系數(shù)小。另外泵起動(dòng)不應(yīng)過(guò)快，可分步操作。如用3mL/min流速，先從lmL/min到2mL/min，然后再3mL/min，每個(gè)間隔應(yīng)大于20s。柱切換技術(shù)的應(yīng)用也很廣泛，切換過(guò)程中在色譜柱的入口處壓力在零到很大數(shù)字之間變化，會(huì)很快使柱報(bào)廢。
色譜柱預(yù)防及維護(hù)—分離條件
多數(shù)色譜柱有很寬的試驗(yàn)條件范圍，但具體應(yīng)用又受到限制，主要是pH值、柱溫和流動(dòng)相的選擇。硅膠為基質(zhì)的鍵合相要求PH在2.5～7之間，極端pH的流動(dòng)相能“溶解"硅膠，使鍵合相流失。結(jié)果非堿性組分的保留不斷減少，堿性組分的保留增加，引起堿性組分峰變寬。如果一定要用高或低pH的流動(dòng)相，可加預(yù)柱(飽和柱)。預(yù)柱裝在泵和進(jìn)樣閥之間，用分析柱相同的填料填裝，或者用普通硅膠。硅膠飽和了流動(dòng)相，減少了分析柱填料的損失。預(yù)柱不要求柱效高，用價(jià)格低的一般硅膠疏松地填裝，按期檢查硅膠的溶解情況。用預(yù)柱也有不利的影響，即新流動(dòng)相難以平衡，保留時(shí)間不穩(wěn)定或穩(wěn)定慢。使用了預(yù)柱一定要加流路過(guò)濾器，以防止硅膠微粒引起的麻煩。以硅膠為基質(zhì)的柱和陰離子交換柱超過(guò)60℃后，會(huì)增加對(duì)流動(dòng)相中化學(xué)物質(zhì)的吸附。在高溫下用小顆粒柱引起柱床塌陷，降低柱效，改變峰形。在40℃以上使用3μm柱，70℃以上使用5μm柱，會(huì)使值降低50%。
色譜柱預(yù)防及維護(hù)—加流路過(guò)濾器和保護(hù)柱
流路過(guò)濾器緊靠進(jìn)樣閥后面，位于分析柱前。0.5μm燒結(jié)不銹鋼片夾在死體積很小的套子中，擋住來(lái)源于樣品和進(jìn)樣閥墊圈的微粒入柱。因?yàn)槊總€(gè)樣品都過(guò)濾既費(fèi)事又帶來(lái)誤差，樣品量少過(guò)濾更困難，因此流路上裝過(guò)濾器是比較省事的辦法。也可以在流路加上保護(hù)柱，放在流路過(guò)濾器和分析柱之間，或者代替流路過(guò)濾器。保護(hù)柱的使命是收集阻塞色譜柱進(jìn)口的來(lái)自樣品的化學(xué)“垃圾"。這種垃圾最終降低柱效能。保護(hù)柱是消耗品，分析50～100個(gè)比較臟的樣品之后就要調(diào)換新的。保護(hù)柱應(yīng)該是小體積，用分析柱的同種填料填裝。保護(hù)柱使用得當(dāng)，對(duì)分離無(wú)影響，好像未裝保護(hù)柱一樣。有些廠商的商品將保護(hù)柱和流路過(guò)濾器連在一個(gè)單元內(nèi)，使用起來(lái)非常方便。自己填裝保護(hù)柱都是用短柱、不超過(guò)3cm長(zhǎng)，內(nèi)徑2～3mm，用較大粒度的填粒(15～20μm)干法填裝，會(huì)使分析柱效略微有所降低。
色譜柱預(yù)防及維護(hù)—用強(qiáng)溶劑定期沖洗色譜柱
每次工作結(jié)束，用強(qiáng)溶劑沖洗柱是良好的習(xí)慣。可用甲醇、乙腈沖反相柱，沖去留在柱上的強(qiáng)吸附組分。用甲醇水為流動(dòng)相時(shí)也應(yīng)沖洗。沖洗的程序在以下章節(jié)中介紹。柱頭的燒結(jié)不銹鋼濾片，要求平整，死體積小，孔徑適當(dāng)(2～5μm)。過(guò)濾片選擇不好會(huì)改變色譜峰形，增加阻力或起不到阻擋污染物的作用(填料很快變色)。
色譜柱預(yù)防及維護(hù)—凈化樣品
用溶劑溶解的樣品，多數(shù)組分在一定的時(shí)間內(nèi)能完全從柱中流出來(lái)，不會(huì)造成危害。有些樣品可能含有微粒物質(zhì)，樣品中的某種組分(如蛋白質(zhì))在柱頭上沉積下來(lái)，組分在固定相上保留很強(qiáng)，溶劑帶走柱填料等，這些都會(huì)造成柱效能下降或?qū)χ鶋勖挠绊?，有必要采取措施防止柱變壞?/p>
如在光線照射下觀察樣品是渾濁的或帶有乳白色，進(jìn)樣前必須要過(guò)濾．雖然流路上裝有過(guò)濾器和保護(hù)柱，但不能代替樣品的前處理，樣品中過(guò)多的微粒會(huì)使過(guò)濾器和保護(hù)柱超載，很快阻塞，或者微粒進(jìn)入分析柱，所以在進(jìn)樣前必須過(guò)濾樣品。
若懷疑樣品與流動(dòng)相混合有沉淀而對(duì)色譜柱有阻塞，應(yīng)先試驗(yàn)一下，看樣品溶液加入流動(dòng)相中有無(wú)變渾或乳白色出現(xiàn)。如果進(jìn)樣后壓力突然增加而后又慢慢減小，表明樣品中有微?；虬l(fā)生沉淀。如有沉淀要設(shè)法改變分離條件，包括換樣品溶劑和流動(dòng)相或處理樣品去掉不溶物質(zhì)。應(yīng)盡量用小體積的樣品。
有些樣品能很強(qiáng)地吸附在柱填料上，這樣會(huì)降低塔板數(shù)，改變樣品的保留物質(zhì)外，還要加保護(hù)柱，定期清洗色譜柱。有時(shí)因?yàn)槭韬?，用?duì)柱有害的溶劑溶解樣品，比如用6mol/L的氫氧化鈉溶解樣品，這樣的樣品只要進(jìn)50～100μL到硅膠基質(zhì)柱中，硅膠就很快溶解而使柱報(bào)廢。在這種情況下，應(yīng)立即中和樣品，或除去原溶劑中的有害成分。
綜上所述，如何保護(hù)良好的柱性能與柱壽命：
1.認(rèn)真閱讀色譜柱使用說(shuō)明書；
2.使用填充良好的色譜柱；
3.盡量減少壓力波動(dòng)，避免機(jī)械及熱沖擊；
4.使用保護(hù)柱及在線過(guò)濾器；
5.經(jīng)常以強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱；
6.充分過(guò)濾樣品及流動(dòng)相，盡量避免雜質(zhì)微粒與強(qiáng)保留成分；
7.用穩(wěn)定的固定相(C18穩(wěn)定);
8.在中等pH值操作時(shí)(6～8)，用有機(jī)緩沖溶液；
9.色譜柱使用溫度可以小于40℃；
10.硅膠基質(zhì)的色譜柱，應(yīng)保持流動(dòng)相的pH值范圍在3.0～8.0；
11.在水流動(dòng)相與緩沖溶液中加200ppm的疊氮鈉；
12.流動(dòng)相中含有緩沖溶液，應(yīng)注意用95：5的水及有機(jī)溶劑過(guò)濾，有機(jī)溶劑不能低于5%；
13.貯存時(shí)，沖洗掉鹽和緩沖液，用純有機(jī)溶劑流動(dòng)相保存。
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