分光光度計(jì)是利用物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收進(jìn)行物質(zhì)的定性或定量分析的儀器，在各行各業(yè)得到了廣泛應(yīng)用，主要用于物質(zhì)純度檢查、定量分析、物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒別等?？蓽y(cè)量結(jié)果總會(huì)出現(xiàn)可接受或不可接受的誤差，誤差來源于測(cè)量過程的各個(gè)方面，我認(rèn)為主要來源于儀器本身性能和測(cè)量條件的選擇兩個(gè)方面。
一、儀器本身性能帶來的誤差
1.雜散光的影響
雜散光是指進(jìn)人檢測(cè)器的處于待測(cè)波長(zhǎng)光譜帶寬范圍外的其他波長(zhǎng)組分，它是光譜測(cè)量中誤差的主要來源。產(chǎn)生原因有:分光光度計(jì)的色散元件、反射鏡、透鏡及單色器內(nèi)壁灰塵等。在分光光度計(jì)工作波段邊緣波長(zhǎng)處，由于單色器透光率、光源輻射強(qiáng)度、檢測(cè)器靈敏度都較低，雜散光的影響更為顯著。雜散光限制儀器的分析上限可引起嚴(yán)重的測(cè)量誤差，實(shí)際工作中，在定量分析時(shí)，一般在吸收峰或其附近處測(cè)量樣品吸光度，如果在分析波長(zhǎng)處含有雜散光，這時(shí)樣品的透光率較小，而雜散光大部分透過，使測(cè)量吸光度低于真實(shí)吸光度。
2.儀器噪聲對(duì)測(cè)量的影響
儀器噪聲也是儀器的一個(gè)重要指標(biāo)，它表征儀器做稀溶液的能力。是疊加在待測(cè)量的分析信號(hào)中的不需要的信號(hào)，掃描100%T和0%T線，可觀察到分光光度計(jì)的絕對(duì)噪聲水平，如果儀器噪聲較大，會(huì)掩蓋較小的測(cè)量信號(hào)，一般用噪音的二倍來表示儀器的靈敏度。
3.波長(zhǎng)和吸光度準(zhǔn)確度
樣品的每一個(gè)值都是在一定的波長(zhǎng)下測(cè)得的，如果波長(zhǎng)誤差很大，測(cè)出的值肯定不準(zhǔn)。吸光度準(zhǔn)確度也是用戶對(duì)儀器的直接要求，更應(yīng)引起足夠的重視。國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程規(guī)定雙光束紫外可見分光光度計(jì)透射比準(zhǔn)確度為A級(jí)士0.6%,B級(jí)土1.0%。
二、測(cè)量條件的選擇
1.吸光度范圍的選擇
試樣在不同吸光度時(shí)，濃度的相對(duì)誤差不同，一般選擇A二0.2一0.8之間，濃度相對(duì)誤差較小，可以通過改變吸收池厚度、檢測(cè)波長(zhǎng)或待測(cè)溶液濃度，使吸光度讀數(shù)在適宜范圍內(nèi)。
2.狹縫寬度的選擇
狹縫寬度不僅影響光譜的純度，也影響吸光度值，在定量分析時(shí)，為了得到足夠的測(cè)量信號(hào)，應(yīng)采用較大狹縫。在定性分析時(shí)，為了提高分辨率，應(yīng)采用較小狹縫，以獲得精細(xì)的光譜結(jié)構(gòu)。
3.吸收池的選擇和使用
吸收池的規(guī)格應(yīng)根據(jù)被測(cè)溶液顏色深淺來確定，一般是被測(cè)溶液顏色深時(shí)選光程短的，顏色淺時(shí)選光程長(zhǎng)的，同一實(shí)驗(yàn)使用同一規(guī)格同一套吸收池。在定量測(cè)量之前需要對(duì)吸收池作校正和配對(duì)工作，吸收池不匹配時(shí)，對(duì)測(cè)量產(chǎn)生誤差，吸收池方向不同，透光率亦有差異，使用時(shí)應(yīng)注意方向。比色皿毛玻璃一面的上端有一個(gè)箭頭，應(yīng)與光路保持一致。另外，使用時(shí)，不要把溶液注得太滿，以防在推動(dòng)比色皿架時(shí)溶液溢出皿外。如透光壁外有溶液存在，要擦干再測(cè)，否則將產(chǎn)生誤差。
分光光度計(jì)的正確使用和保養(yǎng)也很重要，我們應(yīng)該做到以下幾點(diǎn):堅(jiān)持標(biāo)準(zhǔn)溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，不使用過期溶液，比色皿應(yīng)保持清潔、干燥，禁止用硬物碰擦透明表面；防止儀器振動(dòng)，影響測(cè)量穩(wěn)定性;在開機(jī)狀態(tài)，不測(cè)量時(shí)，應(yīng)打開樣品池門，延長(zhǎng)光電傳感器壽命；樣品集中測(cè)量，避免開機(jī)次數(shù)，延長(zhǎng)光源壽命；一旦停機(jī)，則應(yīng)待燈冷卻后再重新啟動(dòng)，并預(yù)熱15min左右再使用；要經(jīng)常更換儀器的干燥劑，防止光學(xué)元件和光電傳感器受潮生霉；儀器搬動(dòng)或更換重要部件后，要重新進(jìn)行性能確認(rèn)，以保證測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確。
熒光分光光度計(jì)是用于掃描液相熒光標(biāo)記物所發(fā)出的熒光光譜的一種儀器。其能提供包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強(qiáng)度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振等許多物理參數(shù)，從各個(gè)角度反映了分子的成鍵和結(jié)構(gòu)情況。熒光分光光度計(jì)具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、用樣量少、方法簡(jiǎn)便、工作曲線線形范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)和藥理學(xué)、有機(jī)和無機(jī)化學(xué)等領(lǐng)域。
熒光分光光度計(jì)工作原理：
由光源氙弧燈發(fā)出的光通過切光器使其變成斷續(xù)之光以及激發(fā)光單色器變成單色光后，此光即為熒光物質(zhì)的激發(fā)光，被測(cè)的熒光物質(zhì)在激發(fā)光照射下所發(fā)出的熒光，經(jīng)過單色器變成單色熒光后照射于測(cè)樣品用的光電倍增管上，由其所發(fā)生的光電流經(jīng)過放大器放大輸至記錄儀，激發(fā)光單色器和熒光單色器的光柵均由電動(dòng)機(jī)帶動(dòng)的凸輪所控制，當(dāng)測(cè)繪熒光發(fā)射光譜時(shí)，將激發(fā)光單色器的光柵，固定在最適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光波長(zhǎng)處，而讓熒光單色器凸輪轉(zhuǎn)動(dòng)，將各波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度訊號(hào)輸出至記錄儀上，所記錄的光譜即發(fā)射光譜（emissionspectrum），簡(jiǎn)稱熒光光譜。
熒光分光光度計(jì)測(cè)試注意事項(xiàng)：
?、贅悠窇?yīng)盛在四面透光的石英比色皿（熒光池）中，如果是揮發(fā)性樣品應(yīng)使用帶塞的熒光池。
?、谠跓晒夥治鰰r(shí)，為了得到穩(wěn)定可靠的數(shù)據(jù)，一般需要開機(jī)預(yù)熱氙燈大約30min。如果儀器光源采用的是閃爍氙燈，預(yù)熱時(shí)間可以縮短到10min左右。對(duì)某些易感光、易分解的熒光物質(zhì)，盡量采用長(zhǎng)波長(zhǎng)、低人射光強(qiáng)度及短時(shí)間光照。
③溫度變化可引起熒光強(qiáng)度的改變。通常降低溫度，有利于提高熒光量子產(chǎn)率，熒光強(qiáng)度增大。溫度影響熒光強(qiáng)度的顯著程度因樣品而異，大部分熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度受溫度影響不大，測(cè)試溫度變化不超過±3℃，對(duì)測(cè)試結(jié)果幾乎無影響。
?、墚?dāng)熒光物質(zhì)是弱酸或弱堿時(shí)，溶液的pH對(duì)熒光強(qiáng)度有較大影響。因?yàn)槿跛峄蛉鯄A在不同酸度中，分子和離子的電離平衡會(huì)發(fā)生改變，而熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度會(huì)因其離解狀態(tài)發(fā)生改變。
?、轃晒馕镔|(zhì)分子與溶液中其它物質(zhì)分子之間作用導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低，常見的熒光猝滅劑，如鹵素離子、重金屬離子、02、硝基化物質(zhì)、重氮化合物等。溶液中的溶解氧也能引起幾乎所有的熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同程度的熒光熄滅現(xiàn)象，因此，在較嚴(yán)格的熒光實(shí)驗(yàn)中必須除02。
紅外分光光度計(jì)由光源發(fā)出的光，被分為能量均等對(duì)稱的兩束，一束為樣品光通過樣品，另一束為參考光作為基準(zhǔn)。這兩束光通過樣品室進(jìn)入光度計(jì)后，被扇形鏡以一定的頻率所調(diào)制，形成交變信號(hào)。
基本原理:
由光源發(fā)出的光，被分為能量均等對(duì)稱的兩束，一束為樣品光通過樣品，另一束為參考光作為基準(zhǔn)。這兩束光通過樣品室進(jìn)入光度計(jì)后，被扇形鏡以一定的頻率所調(diào)制，形成交變信號(hào)，然后兩束光和為一束，并交替通過入射狹縫進(jìn)入單色器中，經(jīng)離軸拋物鏡將光束平行地投射在光柵上，色散并通過出射狹縫之后，被濾光片濾除高級(jí)次光譜，再經(jīng)橢球鏡聚焦在探測(cè)器的接收面上。探測(cè)器將上述交變的信號(hào)轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的電信號(hào)，經(jīng)放大器進(jìn)行電壓放大后，轉(zhuǎn)入A/D轉(zhuǎn)換單位，計(jì)算機(jī)處理后得到從高波數(shù)到低波數(shù)的紅外吸收光譜圖。
應(yīng)用領(lǐng)域:
可廣泛地應(yīng)用在石油、化工、醫(yī)藥、環(huán)保、教學(xué)、材料科學(xué)、公安、國(guó)防等領(lǐng)域。
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