1、液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么？
?、俸Y板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。
②存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動相或更換選擇性好的柱子
?、劭赡苤d，減少進樣量。
2、HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法是什么？
?、贅悠妨坎蛔?，解決辦法為增加樣品量
?、跇悠肺磸闹又辛鞒?。可根據(jù)樣品的化學性質(zhì)改變流動相或柱子
?、蹣悠放c檢測器不匹配。根據(jù)樣品化學性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢測器
?、軝z測器衰減太多。調(diào)整衰減即可。
?、輽z測器時間常數(shù)太大。解決辦法為降低時間參數(shù)
⑥檢測器池窗污染。解決辦法為清洗池窗。
?、邫z測池中有氣泡。解決辦法為排氣。
⑧記錄儀測壓范圍不當。調(diào)整電壓范圍即可。
?、崃鲃酉嗔髁坎缓线m。調(diào)整流速即可。
⑩檢測器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線。
3、做HPLC分析時，柱壓不穩(wěn)定，原因何在？如何解決？
?、俦脙?nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對溶劑進行脫氣處理；
?、诒壤y失效，更換比例閥即可；
?、郾?font color="#0268CA">密封墊損壞，更換密封墊即可；
?、苋軇┲械臍馀荩鉀Q的辦法是對溶劑脫氣，必要時改變脫氣方法；
⑤系統(tǒng)檢漏，找出漏點，密封即可；
?、尢荻认疵摚@時壓力波動是正常的。
4、我購買的HPLC柱驗收測試時柱壓過高，請問為什么？
柱壓過高是HPLC柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因。
①拆去保護預柱，看柱壓是否還高，否則是保護柱的問題，若柱壓仍高，再檢查；
②把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查；
?、蹖⒅拥倪M出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動相沖洗柱子，（此時不要連接檢測器，以防固體顆粒進入流動池）。這時，如果柱壓仍不下降，再檢查；只用于使用過的柱子。
?、芨鼡Q柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商聯(lián)系。一般情況下，在進樣器與保護柱之間接一個在線過濾器便可避免柱壓過高的問題。
5、色譜柱中的流動相會排干嗎？
不少做色譜分離試驗的人遇到過這樣的情形：不慎未及時補充流動相，泵將溶劑瓶中的流動相吸干了，HPLC系統(tǒng)由此而停止工作了。如此情況是否會損壞色譜柱？泵是否已將色譜柱中所有流動相都排干了？色譜柱還能使用嗎？事實上，如果泵將溶劑瓶中的流動相吸干，并不會造成色譜柱的損壞。即使泵中充滿了空氣，泵也不會將空氣排入色譜柱。因為泵只能輸送液體，而不能輸送空氣。
相比之下，另一個更可能發(fā)生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太松而使色譜柱變干。同樣，整個色譜柱干涸的情況不太容易發(fā)生，多半可能只是色譜柱兩端的幾個毫米變干了，因揮發(fā)掉所有溶劑是色譜柱變干需要相當長的時間。即使色譜柱真的變干了，也不一定就不可救藥了?？梢試L試用一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑（如經(jīng)氦氣脫氣的甲醇）沖洗色譜柱以除去氣體。較低的表面張力有助于浸潤填料表面；已脫氣的溶劑應該能夠溶解并去除滯留在填料中的氣體。色譜柱大約需要（以1mL/min的流速）沖一個小時或更多的時間被徹底浸潤，恢復到正常狀態(tài)。
6、為何出現(xiàn)峰展寬？
?、贅悠敷w積過大--用流動相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%
?、谠谶M樣閥中造成峰擴展--進樣前后排出氣泡以降低擴散
?、蹟?shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢--設定速率應是每峰大于10點
④檢測器時間常數(shù)過大--設定時間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的10%
?、萘鲃酉嗾扯冗^高--增加柱溫,采用低粘度流動相
?、迿z測池體積過大--用小體積池,卸下熱交換器
?、弑Ａ魰r間過長--等度洗脫時增加強溶劑含量,也可用梯度洗脫
?、嘀怏w積過大--將連接管徑和連接管長度降至最小
⑨樣品過載--進小濃度小體積樣品
7、除了在線脫氣，常用的實驗室脫氣方式還有哪些？
加熱回流脫氣，脫氣效果較佳，但無法保持；氦脫氣，此方法脫氣效果佳，能除去百分之九十以上的空氣，但氦氣價格太貴，所以用的不多；真空脫氣，效果僅次于氦脫氣，但脫氣過程中容易造成樣品溶液揮發(fā)損失；超聲脫氣，只能脫去約百分之三十的空氣，但在實驗室中常用。目前還是盡量爭取用在線脫氣，方便且效果好。
8、如何簡單判斷比例閥是否內(nèi)漏？
設定泵使用一個單獨通路（A），打開Purge閥，流速5ml/min，提起其他溶劑瓶內(nèi)的溶劑過濾頭直至離開液面，觀察這些通路（B、C、D）內(nèi)的溶劑是否隨著流動，正常時均不應流動。
反相高效液相色譜柱是基于溶質(zhì)、極性流動相和非極性固定相表面間的疏水效應建立的一種色譜模式，任何一種有機分子的結(jié)構(gòu)中都有非極性的疏水部分，這部分越大，一般保留值越高。
在高效液相色譜中這是應用面較廣的一種分離模式，在生物大分子的反相液相色譜條件下，流動相多采用酸性的、低離子強度的水溶液，并加一定比例的能與水互溶的異丙醇、乙腈或甲醇等有機改性劑，大量使用的填料為孔徑在30納米以上的硅膠烷基鍵合相，除此之外，也有少量高聚物微球。
反相高效液相色譜柱的使用和維護
在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。
(1)柱子在裝卸、更換時，動作要輕，接頭擰緊要適度。必須防止較強的機械振動，以免柱床產(chǎn)生空隙。
(2)如果儀器用來做常規(guī)分析，樣品種類有限，但分析次數(shù)多，則不妨為每一類常規(guī)分析配置一根專用柱，這樣有助于延長柱子的壽命。
(3)避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。
溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉(zhuǎn)動不能過緩。
(4)應逐
漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?/p>
(5)如使用柱溫控制裝置時，應注意在通人流動相后才能升溫。
(6)一般說來反相高效液相色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效。
(7)選擇使用適宜的流動相，以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一個預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。
(8)避免將基質(zhì)復雜的樣品尤其是生物樣品直接注人柱內(nèi)，需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一個保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經(jīng)常更換。
(9)經(jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進行清洗時，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50-75mL。
(10)保存色譜柱時應將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時間。
(11)反相高效液相色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時應更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M行清洗；另一種可能是大分子進人柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。
(12)在完成分離分析工作之后，不應立即停機，需及時對色譜分析系統(tǒng)進行沖洗，一般0.5h以上，以除去色譜柱內(nèi)的雜質(zhì)。
在日常分離分析工作中，反相高效液相色譜柱的正確使用和維護十分重要，色譜柱使用是否得當，直接影響色譜柱的壽命，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。
高效液相色譜儀可以完成二元高壓梯度洗脫，也可以拓展為制備系統(tǒng)，采用高壓混合器連接兩個高壓恒流泵，利用RS232通訊，即可實現(xiàn)梯度分析；
便于用戶自由選擇與搭配，混合器材主要由不銹鋼、生物惰性PEEK等構(gòu)成，用途廣泛；
可廣泛應用于研究開發(fā)、醫(yī)藥檢驗、食品檢測、化工分析、環(huán)境監(jiān)測等眾多分析領域。
高效液相色譜儀分離原理：液-液分配(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流動相和固定相都是液體。
流動相與固定相之間應互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分界面。
當試樣進入色譜柱，溶質(zhì)在兩相間進行分配。達到平衡時，高效液相色譜儀報價，服從于高效液相色譜計算公式；
6種定量計算方法：歸一法、修正歸一法、帶比例因子的修正歸一法、內(nèi)標法、外標法，高效液相色譜儀適用范圍，以及指數(shù)計算法。
高效液相色譜儀特點：
1、梯度洗脫內(nèi)部軟件可自控制，編輯、存貯60個梯度方法，運行復雜的梯度程序；
2、泵形式：串聯(lián)雙柱塞 浮動式密封圈；泵頭自沖洗功能，泵無須手動排空即可輸液“自吸式單向閥”技術(shù)，可延長密封圈使用壽命；
3、光路系統(tǒng)采用精密定位結(jié)構(gòu)和獨特的散熱技術(shù)，高效的光學系統(tǒng)和數(shù)字過濾；
4、程序化的溶劑類和壓縮因子，可自動補償；完整的預清洗功能，更于快速溶劑更換；
5、波長調(diào)節(jié)功能：既可由鍵盤面板控制也可由程序軟件設定，全封閉集成型光電檢測元件，無需任何機械部分調(diào)整即可選擇或改變波長；
6、光源運行時間在線監(jiān)測并顯示，方便用戶確定光源壽命；
7、三條流量校正曲線以及特有的多點參數(shù)校正，保障了極高的流量準確性；
8、梯度：高壓2-3元；梯度方式：高壓，梯度洗脫內(nèi)部軟件可自控制，可通過PC機及泵控制；
9、實時顯示樣品池和參比池能量，方便判斷光源和流通池狀態(tài)；
10、紫外檢測器具有自動波長定位調(diào)整，自動調(diào)零，多量程輸出選擇；
11、智能化高，可實現(xiàn)網(wǎng)絡化平臺監(jiān)控，提高了你的QC效益；
12、自動化，讓你從繁鎖的分析操作中解放出更多的時間。
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