流動相相當(dāng)于液相的血液，可以想象對液相的重要程度。那么流動相都需要注意什么呢?
01、過濾溶劑
溶劑在使用前一定要用0.5μm的過濾器過濾，如果使用固體化學(xué)試劑(緩沖鹽)配制流動相，過濾特別重要，不能讓固體微粒污染泵，阻塞進樣器和柱頭過濾片。本實驗室有水溶性和脂溶性兩種過濾膜供選擇(反光面朝上)，過濾水溶性流動相時(如甲醇/水)，先用1～2mL甲醇潤濕過濾膜，有助于快速抽濾。
02、保持儲液瓶的清潔
用普通溶劑瓶作流動相儲液器應(yīng)不定期廢棄瓶子，最后一次應(yīng)用HPLC級的水或溶劑清洗，不能在清洗過程中留下污跡。
03、保證溶劑的質(zhì)量
一定要用HPLC級的溶劑，水也應(yīng)達(dá)到HPLC級，同樣也要使用高純度的緩沖鹽。
一些因流動相引起的常見問題
01、流動相脫氣不充分
流動相受熱，或者流動相不同組分混合時會有氣體產(chǎn)生，氣泡進入泵內(nèi)引起壓力波動，增加噪音，色譜圖上出現(xiàn)毛刺。可試用下列方法解決問題：流動相再脫氣;采用更有效的脫氣方法或兩種方法配合使用;改系統(tǒng)內(nèi)混合為系統(tǒng)外預(yù)混合。
02、流動相供給不暢
流動相用完，管道中吸入氣體引起泵壓力不穩(wěn)。應(yīng)經(jīng)常觀察儲液器中流動相的量，加足流動相保證所有的樣品分析完畢。輸液管道上裝沉子沉至瓶底，儲液器蓋上留一小孔正好夾住進液管，使其不能上下移動。
過濾器阻塞引起管道和泵腔空化，壓力不穩(wěn)。過濾器被微粒所阻塞或長霉，去掉過濾器后如果系統(tǒng)運轉(zhuǎn)正常，說明已找出問題，換上新的過濾器則可。有時候換上新的過濾器仍然不暢，那就需要查查流動相的制備過程，或者換大孔徑的過濾器。不管如何，流動相都需要重新過濾。
流速過高、阻力大，造成空化現(xiàn)象，這是由于過濾器孔徑、管道內(nèi)徑、流速和溶劑黏度等引起的。如果流速大于10mL/min，常會出現(xiàn)這種現(xiàn)象。
使用下列方法解決：
(1)使用低流速;
(2)換大孔徑的過濾器;
(3)增加進液管道內(nèi)徑;
(4)抬高或加壓儲液器;
(5)不用過濾器，但流動相一定要先過濾;
(6)儲液器蓋子太緊，在儲液器內(nèi)形成真空，打出的流動相不連續(xù)。應(yīng)松開蓋子或留有1mm的縫隙;
(7)進液管道阻塞或彎曲使泵抽不到液，注意調(diào)整進液管道或更換新的。其它問題包括滲漏或接頭松動、泵部件損壞等，都能引起供液不正常。
03、流動相和儲液器被污染
由于污染，噪音越來越大，檢測器基線上升。污染物可能被泵以穩(wěn)定的濃度打入系統(tǒng)，而再以穩(wěn)定的濃度流出來，所以在色譜圖中不出多余的峰。用梯度洗脫時弱流動相可以使污染物聚在柱頂，流動相強度增加后污染物可能被洗脫出來一個大的偽峰。有時基線噪音突然增大或突然提高，都是因為反復(fù)加進新的流動相或系統(tǒng)用得太久(通宵)所造成的。新加進的流動相有污染物或者流動相長霉，繁殖了細(xì)菌。
臟的儲液器會污染清潔的流動相。每種流動相備有專用的儲液器，或者定期報廢儲液器。
流動相污染來自這幾個方面
04、試劑質(zhì)量不高，玻璃器皿不合格;
微生物的影響;
配制流動相時操作不當(dāng)?shù)?
因此要求高純度化學(xué)試劑和HPLC級溶劑;
玻璃器皿按規(guī)定清洗干凈;
為防止微生物生長，每天要用甲醇清洗系統(tǒng);
懷疑系統(tǒng)內(nèi)生長了微生物，可用稀硝酸沖洗即可(注意不要損壞柱和管道系統(tǒng));
真空脫氣時防止泵油帶入流動相;
用清潔的惰性塞子、攪棒、過濾器和玻璃器皿配制流動相;
已經(jīng)污染的流動相一定要廢棄掉。
高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。
儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱(固定相) 內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)；
在兩相中做相對運動時，經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。
液相色譜儀系統(tǒng)由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱(固定相)內(nèi);
由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對運動時，經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程;
各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀。
高效液相色譜法只要求樣品能制成溶液，不受樣品揮發(fā)性的限制，流動相可選擇的范圍寬，固定相的種類繁多，因而可以分離熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質(zhì)。
與試樣預(yù)處理技術(shù)相配合，HPLC所達(dá)到的高分辨率和高靈敏度,使分離和同時測定性質(zhì)上十分相近的物質(zhì)成為可能,能夠分離復(fù)雜相體中的微量成分。
隨著固定相的發(fā)展，有可能在充分保持生化物質(zhì)活性的條件下完成其分離HPLC成為解決生化分析問題zui有前途的方法。
由于HPLC具有高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復(fù)利用，流出組分易收集等優(yōu)點，因而被廣泛應(yīng)用到生物化學(xué)、食品分析、環(huán)境分析、無機分析等各種領(lǐng)域。
液相色譜儀與結(jié)構(gòu)儀器的聯(lián)用是一個重要的發(fā)展方向。
液相色譜儀根據(jù)固定相是液體或是固體，又分為液-液色譜(LLC）及液-固色譜(LSC）?，F(xiàn)代液相色譜儀由高壓輸液泵、進樣系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)、色譜柱、檢測器、信號記錄系統(tǒng)等部分組成。與經(jīng)典液相柱色譜裝置比較，具有高效、快速、靈敏等特點。
液相色譜儀操作步驟：
1. 首先對流動相進行過濾，根據(jù)需要選擇不同的濾膜，一般為有機系和水系，常用的孔徑為0.20um和0.45um。
2. 對抽濾后的流動相進行超聲脫氣10-20分鐘。
3. 正常情況下，儀器首先用甲醇沖洗10-20分鐘，然后再進入測試用流動相(如流動相為緩沖試劑，則要二次重蒸水沖洗10-20分鐘，直至色譜柱中有機相沖凈為止) 。
4. 一般情況下，流動相沖洗20-30分鐘后，儀器方可穩(wěn)定，重要的是儀器基線走后，方可進樣測試。
5. 同時進兩針標(biāo)樣，將其結(jié)果相比較，其結(jié)果的比值在0.98-1.02之間后，就可以正式進行樣品的測試了。
6. 樣品測試結(jié)束后，就要進行色譜儀及色譜柱的清洗和維護。如流動相為緩沖試劑，同樣也要用重蒸水清洗10-20分鐘，方可用有機相進行保護，否則，有損色譜柱。
7). 關(guān)機時，先關(guān)計算機，再關(guān)液相色譜。
液相色譜注意事項：
1. 流動相均需色譜純度，水用20M的去離子水。脫氣后的流動相要小心振動盡量不引起氣泡。
2. 柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要讓液體過柱子。
3. 所有過柱子的液體均需嚴(yán)格的過濾。
4. 壓力不能太大，可以不要超過150kgf/cm2 .
5. 因為緩沖試劑遇有機溶劑，會結(jié)晶，有損色譜柱，所以，每次由有機相變流動相或流動相變有機相均需用蒸餾水清洗。
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