高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。
1、液固色譜法
使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用于分離分子量200~1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。
2、液液色譜法
使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。
涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動相必須預(yù)先用固定相飽和，以減少固定相從擔(dān)體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區(qū)別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很少采用?，F(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。
正相色譜法
采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。
反相色譜法
一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用較為廣泛，據(jù)統(tǒng)計，它占整個HPLC應(yīng)用的80%左右。
隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機(jī)樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在pH1.5~10范圍操作。
3、離子交換色譜法
固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進(jìn)行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而分離。
緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān)外，它還受流動相的pH值和離子強(qiáng)度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進(jìn)而影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大，則離子強(qiáng)度高，不利于樣品的解離，導(dǎo)致樣品較快流出。
離子交換色譜法主要用于分析有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。
4、離子對色譜法
又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。
分析堿性物質(zhì)常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強(qiáng)的離子對。
分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。
離子對色譜法常用ODS柱（即C18），流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行分離。被測組分保時間與離子對性質(zhì)、濃度、流動相組成及其pH值、離子強(qiáng)度有關(guān)。
5、排阻色譜法
固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。
高效液相色譜法與氣相色譜法一樣，都屬于色譜法，具有選擇性高、分離效率高、靈敏度高、分析速度快等特點。下面就兩種色譜法的應(yīng)用范圍、儀器構(gòu)造等不同點進(jìn)行比較。
一、氣相與液相的概念
氣相
氣相色譜是一種物理的分離方法。利用被測物質(zhì)各組分在不同兩相間分配系數(shù)(溶解度)的微小差異，當(dāng)兩相作相對運動時，這些物質(zhì)在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次的分配使原來只有微小的性質(zhì)差異產(chǎn)生很大的效果而使不同組分得到分離。
液相
高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上引用了氣相色譜的理論。在技術(shù)上，流動相改為高壓輸送；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而,使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜(每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬)；同時，柱后連有高靈敏度的檢測器可對流出物進(jìn)行連續(xù)檢測。
二、應(yīng)用范圍
氣相
有著分離能力好、靈敏度高、分析速度快、操作方便等特點。受技術(shù)條件的限制，沸點太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng)用氣相色譜法進(jìn)行分析，一般對500℃以下不易揮發(fā)或受熱易分解的物質(zhì)部分可采用衍生化法或裂解法。
液相
高效液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要氣化，因此，不受試樣揮發(fā)性的限制。對于高沸點、熱穩(wěn)定性差、相對分子量大(大于400以上)的有機(jī)物(些物質(zhì)幾乎占有機(jī)物總數(shù)的75%～80%)。原則上，都可應(yīng)用高效液相色譜法來進(jìn)行分離、分析。據(jù)統(tǒng)計，在已知化合物中能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70～80%。
三、氣相儀器構(gòu)造
由載氣源、進(jìn)樣部分、色譜柱、柱溫箱、檢測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。進(jìn)樣部分、色譜柱和檢測器的溫度均在控制狀態(tài)。
1.柱箱：
色譜柱是氣相色譜儀的心臟，樣品中的各個組份在色譜柱中經(jīng)過反復(fù)多次分配后得到分離，從而達(dá)到分析的目的，柱箱的作用就是安裝色譜柱。由于色譜柱的兩端分別連接進(jìn)樣器和檢測器，因此，進(jìn)樣器和檢測器的下端(接頭)均插入柱箱。柱箱能夠安裝各種填充柱和毛細(xì)管柱并且操作方便。色譜柱(樣品)需要在一定的溫度條件下工作，因此，采用微機(jī)對柱箱進(jìn)行溫度控制，并且由于設(shè)計合理，柱箱內(nèi)的梯度很小。
對于一些成份復(fù)雜、沸程較寬的樣品，柱箱還可進(jìn)行三階程序升溫控制。且程序設(shè)定后自動運行無需人工干預(yù)，降溫時還能自動后開門排熱。
2.進(jìn)樣器：
進(jìn)樣器的作用是將樣品送入色譜柱。如果是液體樣品，進(jìn)樣器還必須將其汽化。因此，采用微機(jī)對進(jìn)樣器進(jìn)行溫度控制。
根據(jù)不同種類的色譜柱及不同的進(jìn)樣方式，共有五種進(jìn)樣器可供選擇：
填充柱進(jìn)樣器
毛細(xì)管不分流進(jìn)樣器附件
毛細(xì)管分流進(jìn)樣器附件
毛細(xì)管分流/不分流進(jìn)樣器
六通閥氣體進(jìn)樣器
3.檢測器：
檢測器的作用是將樣品的化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為物理信號(電信號)。
檢測器也需要在一定的溫度條件下才能正常工作，因此，采用微機(jī)對檢測器進(jìn)行溫度控制。
根據(jù)各種樣品的化學(xué)物理特性，共有五種檢測器可供選擇：
氫火焰離子化檢測器(FID)；
熱導(dǎo)檢測器(TCD)；
電子捕獲檢測器(ECD)；
氮磷檢測器(NPD)；
火焰光度檢測器(FPD)；
4.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：
該系統(tǒng)可對測試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。
四、高效液相儀器構(gòu)造
高效液相色譜儀主要有：進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。
1.進(jìn)樣系統(tǒng)
一般采用：隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作，進(jìn)樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。
2.輸液系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為l.47～4.4×107Pa流速可調(diào)且穩(wěn)定，當(dāng)高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動速度，這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存錯和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、pH值。
3.分離系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括：色譜柱、連接管和恒溫器等。
色譜柱一般長度為10～50cm(需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管)內(nèi)徑為2～5mm，由優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，柱內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相(由基質(zhì)和固定液構(gòu)成)，固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹脂或硅膠構(gòu)成，它們都有惰性(如，硅膠表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性和比表面積大的特點，加之其表面經(jīng)過機(jī)械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣)或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因(如，磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等)或配體的有機(jī)化合物。
因此，這類固定相對結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性，例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素(PSA)后，就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來。
另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達(dá)到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)?；|(zhì)粒度小、微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論分析，基質(zhì)粒度小，塔板理論數(shù)N就越大。
這也進(jìn)一步證明基質(zhì)粒度小，會提高分辨率的道理。再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60℃通過改善傳質(zhì)速度，縮短分析時間，就可增加層析柱的效率。
4.檢測系統(tǒng)
高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種：
(1)紫外檢測器
該檢測器適用于對紫外光(或可見光)有吸收性能樣品的檢測。
其特點：使用面廣(如，蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用)；靈敏度高(檢測下限為10-10g/mL)；線性范圍寬；對溫度和流速變化不敏感；可檢測梯度溶液洗脫的樣品。
(2)示差折光檢測器
凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測；糖類化合物的檢測使用此檢測系統(tǒng)。這一系統(tǒng)通用性強(qiáng)、操作簡單，但是，靈敏度低(檢測下限為10-7g/mL)，流動相的變化會引起折光率的變化；因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測。
(3)熒光檢測器
凡具有熒光的物質(zhì)，在一定條件下，其發(fā)射光的熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比。因此，這一檢測器只適用于具有熒光的有機(jī)化合物(如，多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質(zhì)等。。。)的測定，其靈敏度很高(檢測下限為10-12～10-14g/mL)痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可采用。
5.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
該系統(tǒng)可對測試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。
五、高效液相色譜與氣相色譜法優(yōu)點和不足分析
只有20%樣品可不經(jīng)化學(xué)處理而能滿意地用氣相色譜分離，80%的有機(jī)化合物要用高效液相色譜分析。
氣相色譜中流動相是惰性的，它對組分沒有作用力，僅起運載作用、而高效液相色譜的流動相不僅起運載作用，而且流動相對組分有一定親合力，可以通過改變流動相種類和組成提高分離的選擇性；另外，可作流動相的化合物多，選擇余地廣。
與氣相色譜相比，高效液相色譜儀的另一個優(yōu)點是：樣品的回收比較容易，只要開口容器放在柱子末端，就可以很容易地將所分離的各組分收集?；厥帐嵌康模梢杂脕硖峒兒椭苽渚哂凶銐蚣兌鹊膯我晃镔|(zhì)。
高效液相色譜不足的是，日前，檢測器的靈敏度不及氣相色譜。必須特別注意“柱外效應(yīng)”對柱效率及色譜分離的影響。
以上內(nèi)容由捷配儀器儀表網(wǎng)小編為您整理提供，希望能幫到您，祝您工作學(xué)習(xí)愉快
1、反相柱
分別用甲醇:水=90:10，純甲醇（HPLC級），異丙醇（HPLC級），二氯甲烷（HPLC級）等溶劑作為流動相，依次沖洗，每種流動相流經(jīng)色譜柱不少于20倍的色譜柱體積.然后再以相反的次序沖洗。
2、正相柱
分別用正己烷（HPLC級），異丙醇（HPLC級），二氯甲烷（HPLC級），甲醇（HPLC級）等溶劑做流動相，順次沖洗，每種流動相流經(jīng)色譜柱不少于20倍的柱體積(異丙醇粘度大，可降低流速，避免壓力過高).注意使用溶劑的次序不要顛倒，用甲醇沖洗完后，再以相反的次序沖洗至正己烷，所有的流動相必須嚴(yán)格脫水。
3、離子交換柱
長時間在緩沖溶液中使用和進(jìn)樣，將導(dǎo)致色譜柱離子交換能力下降，用稀酸緩沖溶液沖洗可以使陽離子柱再生，反之，用稀堿緩沖溶液沖洗可以使陰離子柱再生。
另外，還可以選擇能溶解柱內(nèi)污染物的溶劑為流動相做正方向和反方向沖洗。但再生后的色譜柱柱效是不可能恢復(fù)到新柱的水平的.如果柱子裝反了，可以調(diào)回來，但可能會造成柱內(nèi)擔(dān)體塌陷.在不得已的情況下盡量不要反裝色譜柱。
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