在液相色譜儀分析中，根據(jù)流動相和固定相相對極性的不同，可分為正相色譜和反相色譜。所謂正相色譜是指固定相極性大于流動相極性的情況，反之，固定相的極性小于流動相的極性，則稱為反相色譜。
正相分析的場合：
假設使用的溶劑是15%二氯甲烷/己烷混合溶液，樣品在二氯甲烷中更易溶解。如果樣品可以在流動相中完全溶解自然沒有問題。
如果樣品不能溶解在溶劑中，選擇100%二氯甲烷作為溶劑的情況下可能會產(chǎn)生故障。
在一般情況下，經(jīng)常使用混合溶劑作為流動相。哪種組合最易于樣品溶解可以從樣品的洗脫時間上看出。在選擇溶解樣品的溶劑之前，把流動相的組成在5~10%變化范圍內(nèi)各種樣品的洗脫時間作比較，選擇樣品最容易溶解的溶劑。因為，樣品和溶劑、流動相互相溶解是分析的前提條件。
反相分析的場合：
假設使用的溶劑是50%的乙腈，使用的樣品在乙腈中比在水中更易溶解。當然，可以的方法是使樣品完全溶解于流動相中。
然而，如果樣品不能溶解在流動相中，如何選擇溶劑呢？100%的乙腈溶液？或者濃度50%以下的乙腈水溶液？這種情況下，第一個選擇就是濃度50%以下的乙腈水溶液。第二個選擇就是100%的水溶液，可以100~500微升注入。最差的選擇是100%乙腈溶液。因為即使樣品完全溶解在了100%的乙腈溶液中，隨著流動相的加入，可能乙腈溶液被稀釋導致樣品析出。輕則造成上述a,b兩種故障，重則向c,d發(fā)展。最嚴重則發(fā)生f的故障，那就只能更換色譜柱了。
然而，混合樣品的情況下可能發(fā)生g的故障。判斷樣品會不會在色譜柱內(nèi)部析出可以通過以下步驟。減少樣品較易溶解的，溶劑量，然后試著增加注入量。也就是說，如果是要求注入在100%乙腈溶液中溶解的樣品20ul，可以試著注入在20%乙腈中溶解的樣品125ul。如果上述的故障消失了，則說明使用100%乙腈作為溶劑是不合適的，樣品會在色譜柱內(nèi)析出。
早期使用隔膜和停流進樣器，裝在色譜柱進口處?，F(xiàn)在大都使用六通進樣閥或自動進樣器。
進樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。HPLC進樣方式可分為：隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。
1.隔膜進樣。
用微量注射器將樣品注進專門設計的與色譜柱相連的進樣頭內(nèi)，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎即是零，可以獲得較佳的柱效，且價格便宜，操縱方便。但不能在高壓下使用(如10MPa以上);此外隔膜輕易吸附樣品產(chǎn)生記憶效應，使進樣重復性只能達到1~2%;加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規(guī)分析使用受到限制。
2.停流進樣。
可避免在高壓下進樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動時往往會出現(xiàn)“鬼峰”;另一缺點是保存時間不準。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。
3.閥進樣。
一般HPLC分析常用六通進樣閥(以美國Rheodyne公司的7725和7725i型常見)，其關鍵部件由圓形密封墊(轉子)和固定底座(定子)組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進樣(約下降5~10%左右)，但耐高壓(35~40MPa)，進樣量正確，重復性好(0.5%)，操縱方便。
4.自動進樣。
用于大量樣品的常規(guī)分析。
液相色譜儀常見的故障一是堵，二是漏，本文通過三大原因給大家說說，液相色譜儀為何會堵？
原因一：配制流動相時細菌污染
首先，我們要認識到，一般的國產(chǎn)甲醇其實不需要額外過濾處理，直接使用沒有問題。即使是有些固態(tài)微粒雜質，也能在液相流路系統(tǒng)最前端的過濾頭上排除，真正容易引起問題的，是水中的細菌。
原因二：使用流動相時的細菌污染
流動相剛開始沒有長菌，在使用時卻產(chǎn)生了細菌污染。這主要是在使用多元液相色譜儀時的一種不良使用習慣造成的。
舉簡單的例子：
50％的甲醇水流動相，有兩種使用方式。一種方式是在上機前就配好混合在一起，另一種方式是在流路A放純甲醇，流路B放純水。
從單純實驗效果來說，后一種有明顯的優(yōu)點：首先是簡單，不需要實驗者另個計算配比混合，其次就是比例準確，能得到保留時間重復性極好的實驗效果。
但是，它有一個致命的缺陷，就是純水在流動相瓶中幾天時間就會長細菌很多情況下不僅僅用純水作流動相，而是用緩沖鹽溶液，本身就是優(yōu)質肥料，細菌長得更迅速、，一旦有細菌柱子就壞得很快。所以這種方式要求操作人員每次實驗都要用新制備的純水，更要求在每次實驗后把水相換掉，換成甲醇沖洗干凈，這一點在實際工作中很多人意識不強，就是意識到了但多次使用中總有一兩次會遺漏，但是往往這一兩次就足以產(chǎn)生致命的影響。因為液相色譜柱的堵塞是不可逆的。
所以，寧可犧牲小小的保留時間的重復性，也不要用純水溶液作為流動相的一組。從實際實驗效果來說，我建議用10％的甲醇水代替純水溶液以前我做過不同比例甲醇水的細菌總數(shù)實驗，在5％就基本可以抑菌，在10％及以上就可以完全殺菌了、，這樣可以有效排除長細菌的隱患，既可作流動相，也可沖柱。就算是在配制流動相時會計算得麻煩一些，但是一次麻煩，終身受益。
原因三：不適當操作
1、在更換零件時選擇的型號有誤，接口不是很匹配，在擰緊的時候產(chǎn)生變形而使得管路堵塞。
2、樣品處理液凈化得不干凈，長期會在六通閥和柱之間形成阻塞不暢。
3、在使用手動六通閥時，有些人可能由于手勁小的原因，轉動的不到位，于是造成流路形成了死堵，壓力快速升高超過警戒值。
4、在使用金屬管路作出廢液管時，應當注意可以廢液瓶中先放一些水，并把廢液管的出口端放在液面下。如果位于在液相上且實驗使用較高濃度的緩沖鹽溶液，在停機時可能在出口端結晶成塊并造成堵塞。這種情況不常見，但卻的確發(fā)生過。
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