高效液相色譜法與氣相色譜法一樣，都屬于色譜法，具有選擇性高、分離效率高、靈敏度高、分析速度快等特點(diǎn)。下面就兩種色譜法的應(yīng)用范圍、儀器構(gòu)造等不同點(diǎn)進(jìn)行比較。

    一、氣相與液相的概念

    氣相

    氣相色譜是一種物理的分離方法。利用被測(cè)物質(zhì)各組分在不同兩相間分配系數(shù)(溶解度)的微小差異，當(dāng)兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，這些物質(zhì)在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次的分配使原來(lái)只有微小的性質(zhì)差異產(chǎn)生很大的效果而使不同組分得到分離。

    液相

    高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上引用了氣相色譜的理論。在技術(shù)上，流動(dòng)相改為高壓輸送；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而,使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜(每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬(wàn)或幾十萬(wàn))；同時(shí)，柱后連有高靈敏度的檢測(cè)器可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。

    二、應(yīng)用范圍

    氣相

    有著分離能力好、靈敏度高、分析速度快、操作方便等特點(diǎn)。受技術(shù)條件的限制，沸點(diǎn)太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng)用氣相色譜法進(jìn)行分析，一般對(duì)500℃以下不易揮發(fā)或受熱易分解的物質(zhì)部分可采用衍生化法或裂解法。

    液相

    高效液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要?dú)饣?，因此，不受試樣揮發(fā)性的限制。對(duì)于高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、相對(duì)分子量大(大于400以上)的有機(jī)物(些物質(zhì)幾乎占有機(jī)物總數(shù)的75%～80%)。原則上，都可應(yīng)用高效液相色譜法來(lái)進(jìn)行分離、分析。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在已知化合物中能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70～80%。

    三、氣相儀器構(gòu)造

    由載氣源、進(jìn)樣部分、色譜柱、柱溫箱、檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。進(jìn)樣部分、色譜柱和檢測(cè)器的溫度均在控制狀態(tài)。

    1.柱箱：

    色譜柱是氣相色譜儀的心臟，樣品中的各個(gè)組份在色譜柱中經(jīng)過(guò)反復(fù)多次分配后得到分離，從而達(dá)到分析的目的，柱箱的作用就是安裝色譜柱。由于色譜柱的兩端分別連接進(jìn)樣器和檢測(cè)器，因此，進(jìn)樣器和檢測(cè)器的下端(接頭)均插入柱箱。柱箱能夠安裝各種填充柱和毛細(xì)管柱并且操作方便。色譜柱(樣品)需要在一定的溫度條件下工作，因此，采用微機(jī)對(duì)柱箱進(jìn)行溫度控制，并且由于設(shè)計(jì)合理，柱箱內(nèi)的梯度很小。

    對(duì)于一些成份復(fù)雜、沸程較寬的樣品，柱箱還可進(jìn)行三階程序升溫控制。且程序設(shè)定后自動(dòng)運(yùn)行無(wú)需人工干預(yù)，降溫時(shí)還能自動(dòng)后開(kāi)門排熱。

    2.進(jìn)樣器：

    進(jìn)樣器的作用是將樣品送入色譜柱。如果是液體樣品，進(jìn)樣器還必須將其汽化。因此，采用微機(jī)對(duì)進(jìn)樣器進(jìn)行溫度控制。

    根據(jù)不同種類的色譜柱及不同的進(jìn)樣方式，共有五種進(jìn)樣器可供選擇：

    填充柱進(jìn)樣器

    毛細(xì)管不分流進(jìn)樣器附件

    毛細(xì)管分流進(jìn)樣器附件

    毛細(xì)管分流/不分流進(jìn)樣器

    六通閥氣體進(jìn)樣器

    3.檢測(cè)器：

    檢測(cè)器的作用是將樣品的化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為物理信號(hào)(電信號(hào))。

    檢測(cè)器也需要在一定的溫度條件下才能正常工作，因此，采用微機(jī)對(duì)檢測(cè)器進(jìn)行溫度控制。

    根據(jù)各種樣品的化學(xué)物理特性，共有五種檢測(cè)器可供選擇：

    氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)；

    熱導(dǎo)檢測(cè)器(TCD)；

    電子捕獲檢測(cè)器(ECD)；

    氮磷檢測(cè)器(NPD)；

    火焰光度檢測(cè)器(FPD)；

    4.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：

    該系統(tǒng)可對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開(kāi)展。

    四、高效液相儀器構(gòu)造

    高效液相色譜儀主要有：進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。

    1.進(jìn)樣系統(tǒng)

    一般采用：隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作，進(jìn)樣量是恒定的。這對(duì)提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。

    2.輸液系統(tǒng)

    該系統(tǒng)包括高壓泵、流動(dòng)相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為l.47～4.4×107Pa流速可調(diào)且穩(wěn)定，當(dāng)高壓流動(dòng)相通過(guò)層析柱時(shí)，可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動(dòng)速度，這對(duì)提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動(dòng)相貯存錯(cuò)和梯度儀，可使流動(dòng)相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、pH值。

    3.分離系統(tǒng)

    該系統(tǒng)包括：色譜柱、連接管和恒溫器等。

    色譜柱一般長(zhǎng)度為10～50cm(需要兩根連用時(shí)，可在二者之間加一連接管)內(nèi)徑為2～5mm，由優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，柱內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相(由基質(zhì)和固定液構(gòu)成)，固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹(shù)脂或硅膠構(gòu)成，它們都有惰性(如，硅膠表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性和比表面積大的特點(diǎn)，加之其表面經(jīng)過(guò)機(jī)械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣)或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因(如，磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長(zhǎng)度碳鏈的烷基等)或配體的有機(jī)化合物。

    因此，這類固定相對(duì)結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性，例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素(PSA)后，就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來(lái)。

    另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達(dá)到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)?；|(zhì)粒度小、微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對(duì)縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論分析，基質(zhì)粒度小，塔板理論數(shù)N就越大。

    這也進(jìn)一步證明基質(zhì)粒度小，會(huì)提高分辨率的道理。再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60℃通過(guò)改善傳質(zhì)速度，縮短分析時(shí)間，就可增加層析柱的效率。

    4.檢測(cè)系統(tǒng)

    高效液相色譜常用的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器三種：

    (1)紫外檢測(cè)器

    該檢測(cè)器適用于對(duì)紫外光(或可見(jiàn)光)有吸收性能樣品的檢測(cè)。

    其特點(diǎn)：使用面廣(如，蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用)；靈敏度高(檢測(cè)下限為10-10g/mL)；線性范圍寬；對(duì)溫度和流速變化不敏感；可檢測(cè)梯度溶液洗脫的樣品。

    (2)示差折光檢測(cè)器

    凡具有與流動(dòng)相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)；糖類化合物的檢測(cè)使用此檢測(cè)系統(tǒng)。這一系統(tǒng)通用性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，但是，靈敏度低(檢測(cè)下限為10-7g/mL)，流動(dòng)相的變化會(huì)引起折光率的變化；因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測(cè)。

    (3)熒光檢測(cè)器

    凡具有熒光的物質(zhì)，在一定條件下，其發(fā)射光的熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比。因此，這一檢測(cè)器只適用于具有熒光的有機(jī)化合物(如，多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質(zhì)等。。。)的測(cè)定，其靈敏度很高(檢測(cè)下限為10-12～10-14g/mL)痕量分析和梯度洗脫作品的檢測(cè)均可采用。

    5.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

    該系統(tǒng)可對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開(kāi)展。

    五、高效液相色譜與氣相色譜法優(yōu)點(diǎn)和不足分析

    只有20%樣品可不經(jīng)化學(xué)處理而能滿意地用氣相色譜分離，80%的有機(jī)化合物要用高效液相色譜分析。

    氣相色譜中流動(dòng)相是惰性的，它對(duì)組分沒(méi)有作用力，僅起運(yùn)載作用、而高效液相色譜的流動(dòng)相不僅起運(yùn)載作用，而且流動(dòng)相對(duì)組分有一定親合力，可以通過(guò)改變流動(dòng)相種類和組成提高分離的選擇性；另外，可作流動(dòng)相的化合物多，選擇余地廣。

    與氣相色譜相比，高效液相色譜儀的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是：樣品的回收比較容易，只要開(kāi)口容器放在柱子末端，就可以很容易地將所分離的各組分收集?；厥帐嵌康模梢杂脕?lái)提純和制備具有足夠純度的單一物質(zhì)。

    高效液相色譜不足的是，日前，檢測(cè)器的靈敏度不及氣相色譜。必須特別注意“柱外效應(yīng)”對(duì)柱效率及色譜分離的影響。

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