液相色譜儀根據(jù)固定相是液體或是固體，又分為液-液色譜(LLC)及液-固色譜(LSC)。高效液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，下面將針對(duì)3大系統(tǒng),敘述其各自的組成與特點(diǎn)。
1．進(jìn)樣系統(tǒng)
液相色譜儀一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作，進(jìn)樣量是恒定的。這對(duì)提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。
2．輸液系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括高壓泵、流動(dòng)相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為l．47～4．4X10Pa，流速可調(diào)且穩(wěn)定，當(dāng)高壓流動(dòng)相通過(guò)層析柱時(shí)，可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動(dòng)速度，這對(duì)提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動(dòng)相貯存器和梯度儀，可使流動(dòng)相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、PH值，或改用競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(zhì)(即使僅有一個(gè)基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體)都能獲得有效分離。
3.分離系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長(zhǎng)度為10～50cm(需要兩根連用時(shí)，可在二者之間加一連接管)，內(nèi)徑為2～5mm，由優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，住內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相(由基質(zhì)和固定液構(gòu)成)．固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹脂或硅膠構(gòu)成，它們都有惰性(如硅膠表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔徑可達(dá)1000?)和比表面積大的特點(diǎn)，加之其表面經(jīng)過(guò)機(jī)械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣)，或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因(如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長(zhǎng)度碳鏈的烷基等)或配體的有機(jī)化合物。因此，這類固定相對(duì)結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素(PSA)后，就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來(lái)。另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達(dá)到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)?；|(zhì)粒度小，微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對(duì)縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論分析，基質(zhì)粒度小，塔板理論數(shù)N就越大。這也進(jìn)一步證明基質(zhì)粒度小，會(huì)提高分辨率的道理。再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60C，通過(guò)改善傳質(zhì)速度，縮短分析時(shí)間，就可增加層析柱的效率。
高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成。與經(jīng)典的液相色譜相比，具有高效液相所用的固定相粒度?。?um-10um）、傳質(zhì)快、柱效高的優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，在保健食品功效成分、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、維生素類、蛋白質(zhì)的分離測(cè)定等應(yīng)用廣泛。世界上約有80％的有機(jī)化合物可以用HPLC來(lái)分析測(cè)定。
高效液相色譜的分離過(guò)程HPLC，借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。
高效液相色譜儀操作步驟：
1)過(guò)濾流動(dòng)相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜。
2)對(duì)抽濾后的流動(dòng)相進(jìn)行超聲脫氣10-20分鐘。
3)打開HPLC工作站(包括計(jì)算機(jī)軟件和色譜儀)，連接好流動(dòng)相管道，連接檢測(cè)系統(tǒng)。
4)進(jìn)入HPLC控制界面主菜單，點(diǎn)擊manual，進(jìn)入手動(dòng)菜單。
5)一段時(shí)間沒(méi)用，或者換了新的流動(dòng)相，需要先沖洗泵和進(jìn)樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽取。沖洗進(jìn)樣閥，需要在manual菜單下，先點(diǎn)擊purge，再點(diǎn)擊start，沖洗時(shí)速度不要超過(guò)10ml/min。
6)調(diào)節(jié)流量，初次使用新的流動(dòng)相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過(guò)2000。點(diǎn)擊injure，選用合適的流速，點(diǎn)擊on，走基線，觀察基線的情況。
7)設(shè)計(jì)走樣方法。點(diǎn)擊file，選取selectusersandmethods，可以選取現(xiàn)有的各種走樣方法。若需建立一個(gè)新的方法，點(diǎn)擊newmethod。選取需要的配件，包括進(jìn)樣閥，泵，檢測(cè)器等，根據(jù)需要而不同。選完后，點(diǎn)擊protocol。一個(gè)完整的走樣方法需要包括：a.進(jìn)樣前的穩(wěn)流，一般2-5分鐘；b.基線歸零；c.進(jìn)樣閥的loading-inject轉(zhuǎn)換；d.走樣時(shí)間，隨不同的樣品而不同。
8)進(jìn)樣和進(jìn)樣后操作。選定走樣方法，點(diǎn)擊start。進(jìn)樣，所有的樣品均需過(guò)濾。方法走完后，點(diǎn)擊postrun，可記錄數(shù)據(jù)和做標(biāo)記等。全部樣品走完后，再用上面的方法走一段基線，洗掉剩余物。
9)關(guān)機(jī)時(shí)，先關(guān)計(jì)算機(jī)，再關(guān)液相色譜。
液相色譜儀的原理就是利用待分離的各種物質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)、吸附能力等親和能力的不同來(lái)進(jìn)行分離的。使用外力使含有樣品的流動(dòng)相氣體、液體、通過(guò)一固 定于柱中或平板上、與流動(dòng)相互不相溶的固定相表面。當(dāng)流動(dòng)相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時(shí)，混合物中的各組分與固定相發(fā)生相互作用。
液相色譜儀的保養(yǎng)：
1、至少每天進(jìn)行一次檢漏。
2、泵正在帶壓工作時(shí)，不可拆卸其部件除非有經(jīng)驗(yàn)的維修人員在進(jìn)行故障處理、。
3、配制兩種或兩種以上洗脫液時(shí)，一定要先脫氣再使用，保證流動(dòng)相系統(tǒng)中不要形成氣泡。
4、定期檢查泵的潤(rùn)滑，只使用儀器說(shuō)明書指定的潤(rùn)滑油。
5、定期檢查檢測(cè)器噪聲、漂移，定期進(jìn)行檢測(cè)器校正。
6、除非實(shí)踐證明其它純度級(jí)別的溶劑可用，否則使用高效液相色譜流動(dòng)相專用試劑。
7、更換溶劑時(shí)，一定要對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行沖洗。如果兩種溶劑互不相溶，則應(yīng)先用與這兩種溶劑都能互溶的溶劑進(jìn)行沖洗，再用新溶劑進(jìn)行沖洗。
8、柱子不論何時(shí)都不能拆卸下接頭，以免損失柱效，廢掉柱子。
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