輸液泵/高壓泵是保證HPLC系統(tǒng)流路暢通、流量精確和壓力穩(wěn)定的重要儀器部件。目前多用往復(fù)式恒流柱塞泵。主要由柱塞桿、密封墊圈和兩個單項(xiàng)閥組成,用馬達(dá)帶動凸輪驅(qū)動柱塞桿作吸液和排液的往復(fù)運(yùn)動。常見泵的故障主要有以下幾種,并提供解決的辦法。
1、單向閥故障
由于球與閥座密封不嚴(yán),導(dǎo)致液體倒流,造成壓力不穩(wěn),甚至球與閥座粘在一起阻死。為避免單項(xiàng)閥中的寶石球和閥座被污染,流動相應(yīng)使用HPLC級的溶劑,并且配好的流動相一定要用0.45um濾膜過濾和脫氣。如果泵被微粒污染,可分別用25ml水25ml甲醇25ml異丙醇25ml二氯甲烷依次沖洗,最后再用所用的溶液沖洗整個系統(tǒng)。注意:沖洗時應(yīng)打開泄液閥。如果氣泡進(jìn)入閥中,它會緊貼在閥體的一側(cè),使寶石球難返回到閥座,引起液體倒流,導(dǎo)致泵的壓力和流速明顯改變。此時應(yīng)立即打開瀉液閥,大流量(2ml/min)沖洗泵,直至排除液為直線型。如果泵進(jìn)氣泡也可在泵頭上排氣泡,具體做法為:用扳手固定住進(jìn)氣泡的泵頭,擰開輸出管道的壓帽,手動泵進(jìn)液,這時可見到氣泡從孔中擠壓出來,直至無氣泡排出將壓帽擰緊。如果采取上述方法仍不能使壓力穩(wěn)定,應(yīng)考慮是密封墊圈壞了?或單向閥磨損、球不光滑等,需更換部件。
2、泵墊圈故障
泵墊圈常見的故障是滲漏和墊圈受損污染系統(tǒng).液相色譜系統(tǒng)一般情況下不要使用強(qiáng)酸強(qiáng)堿溶液,樣品PH值一般調(diào)到中性,才可進(jìn)樣。如果強(qiáng)酸強(qiáng)堿會損壞密封墊和柱塞桿。密封圈與運(yùn)動著的柱塞桿緊密接觸,可使柱塞在泵頭自由運(yùn)動而流動相不漏出來,它是液相色譜中最易磨損的部件。有條件的實(shí)驗(yàn)室可三個月更換一次墊圈,以防止泵系統(tǒng)污染。如果用緩沖鹽作流動相則更會加速墊圈的磨損,應(yīng)及時沖洗。墊圈損壞一般表現(xiàn)為:泵壓力不穩(wěn)、泵頭漏液。為避免上述故障的發(fā)生,我們在分析中應(yīng)注意以下幾點(diǎn):
?、偈褂贸兯?、純度級別較高的試劑和色譜級溶劑配制流動相;
?、谂浜玫牧鲃酉嘁欢ㄒ闉V脫氣,即便儀器有在線脫氣裝置,也可以在上機(jī)前進(jìn)行抽濾;
?、郾迷趩忧耙欢ㄒㄟ^泄液閥抽凈泵里的空氣;
?、苡镁彌_鹽洗脫時,分析結(jié)束后一定要用水沖洗泵和整個流路系統(tǒng),最后用有機(jī)溶劑充滿系統(tǒng)。
高效液相色譜儀分析中進(jìn)樣基線很好，保留時間能鎖定，壓力也穩(wěn)定，但是峰面積差別很大，大概有2倍的差別，這種情況出現(xiàn)的原因可能是多方面的，建議采用以下方法解決：
1、調(diào)換一根新色譜柱，如果情況一樣，則排除柱子的原因。
2、將在線過濾器拆下，用超聲波清洗，如果結(jié)果一樣，說明與在線過濾器無關(guān)。
3、考慮是不是進(jìn)樣閥有問題或者定量環(huán)堵。建議多進(jìn)幾針樣品，看是否有規(guī)律，如果沒有規(guī)律，應(yīng)檢查一下進(jìn)樣器的其他部位，如果是進(jìn)樣器系統(tǒng)出現(xiàn)問題，應(yīng)盡快解決之。
4、對進(jìn)樣器清洗一下，清洗干凈后先進(jìn)一針空白，再進(jìn)樣，看看結(jié)果如何，如果有明顯減少，那可能是進(jìn)樣器污染，有樣品殘留在進(jìn)樣閥體內(nèi)，在切換的過程中被流動相帶入色譜柱。
5、考慮樣品溶液是否均勻。建議同一個濃度連續(xù)進(jìn)樣5次，看一下結(jié)果如何變化，有沒有規(guī)律；如果是樣品溶液不均勻，可以再攪拌一下。
6、考慮光源是不是正常。
7、考慮濃度是否在線性范圍內(nèi)。有時候定量時濃度太高或太低都會產(chǎn)生較大的分析誤差。
8、考慮取樣方式是否正確，每次取樣后是否對針頭外面的附著液進(jìn)行清除。
9、高效液相色譜儀的計算機(jī)軟件編制可能存在問題。對比可以適當(dāng)改變軟件。
高效液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、。分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，下面將分別敘述其各自的組成與特點(diǎn)。
1.進(jìn)樣系統(tǒng)一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作，進(jìn)樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。
2.輸液系統(tǒng)該系統(tǒng)包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。
高壓泵的一般壓強(qiáng)為l。47～4。4X107Pa，流速可調(diào)且穩(wěn)定，當(dāng)高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動速度，這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。
流動相貯存錯和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、PH值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。
這就可使各種物質(zhì)(即使僅有一個基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體)都能獲得有效分離。
3.分離系統(tǒng)該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長度為10～50cm(需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管)，內(nèi)徑為2～5mm，由"優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，住內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相(由基質(zhì)和固定液構(gòu)成)。
固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹脂或硅膠構(gòu)成，它們都有惰性(如硅膠表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔徑可達(dá)1000?)和比表面積大的特點(diǎn)，加之其表面經(jīng)過機(jī)械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣)，或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因(如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等)或配體的有機(jī)化合物。
因此，這類固定相對結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性。
例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素(PSA)后，就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來。
另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達(dá)到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)?；|(zhì)粒度小，微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。
根據(jù)柱效理論分析，基質(zhì)粒度小，塔板理論數(shù)N就越大。這也進(jìn)一步證明基質(zhì)粒度小，會提高分辨率的道理。
再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60C，通過改善傳質(zhì)速度，縮短分析時間，就可增加層析柱的效率。
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