高效液相色譜儀色譜柱在色譜分析系統(tǒng)中主要起著分離檢測(cè)物質(zhì)的作用，如同色譜系統(tǒng)的心臟，同時(shí)也是易損耗品。什么情況下會(huì)導(dǎo)致液相色譜柱柱效降低甚至“失效”。
1、篩板堵塞
色譜柱入口篩板堵塞是常見(jiàn)的問(wèn)題之一，會(huì)導(dǎo)致柱壓升高、色譜峰拖尾、塔板數(shù)降低等問(wèn)題。通常分析樣品中微粒雜質(zhì)最右可能堵塞色譜柱入口，因此分析時(shí)，需要先過(guò)濾或者離心，乳濁或渾濁樣品應(yīng)以0.25?m濾膜處理，也可用針頭過(guò)濾器過(guò)濾。進(jìn)樣器與泵密封墊的磨損也會(huì)帶入微粒，在進(jìn)樣閥與色譜柱之間使用0.25?m或0.45?m的在線過(guò)濾器，通?？梢员苊膺@類(lèi)問(wèn)題
2、強(qiáng)保留樣品組分
強(qiáng)吸附性的樣品組分吸附在柱頭填料上，能?chē)?yán)重地影響色譜柱壽命。像生物組織或體液的提取物、天然產(chǎn)物等復(fù)雜樣品，極易造成柱頭的污染。相對(duì)較純的樣品，一般不會(huì)出現(xiàn)這一問(wèn)題。色譜柱應(yīng)用中，色譜峰嚴(yán)重拖尾或分裂往往是強(qiáng)保留污染物在柱頭吸附的體現(xiàn)。
3、色譜柱裝填不良
裝填不良的色譜柱，在短時(shí)間應(yīng)用后，填充床的壓縮通常使柱頭處產(chǎn)生塌陷，導(dǎo)致柱效突然降低。色譜柱的初始評(píng)價(jià)指標(biāo)，如塔板數(shù)、不對(duì)稱因子等往往不能很好地表征色譜柱床層的穩(wěn)定性，這種情緒只能在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)。
4、壓力因素
液相色譜儀色譜柱使用過(guò)程中的驟然壓力波動(dòng)、機(jī)械撞擊或溫度驟然變化都會(huì)對(duì)色譜柱床層產(chǎn)生影響，導(dǎo)致峰形變差和柱效降低。進(jìn)樣過(guò)程中，進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)動(dòng)太慢可引起壓力波動(dòng)，使色譜柱床產(chǎn)生裂隙，在柱切換時(shí)也存在同樣的問(wèn)題。使用填充良好的色譜柱，在較低柱壓下操作，可大大減少由壓力波動(dòng)造成的色譜柱損壞。
有些色譜柱廠家建議在使用液相色譜柱時(shí)加入保護(hù)柱，保護(hù)柱是收集、阻斷來(lái)自進(jìn)樣器的機(jī)械和化學(xué)雜質(zhì)，以保護(hù)和延長(zhǎng)分析柱的使用壽命。
柱子的再生
色譜柱屬于色譜分析的常用消耗品，它是有壽命的；但它壽命的長(zhǎng)短與我們的樣品處理程度、有無(wú)加保護(hù)柱以及清洗是否恰當(dāng)和徹底緊密相關(guān)！當(dāng)柱子在使用一段時(shí)間以后，它的柱壓可能升高，柱效可能降低，這時(shí)如果我們對(duì)柱子進(jìn)行再生，它的壽命也許會(huì)得到一定的延長(zhǎng)。
柱子使用
1、首先要確認(rèn)您所要分析的樣品流動(dòng)相的pH范圍是否在您的柱子的pH范圍之內(nèi)，以免損壞柱子硅膠！
2、接下來(lái)就是用你做樣品的流動(dòng)相去平衡柱子，如果您的流動(dòng)相中含有緩沖鹽溶液，在平衡柱子之前務(wù)必要先用5％的甲醇(乙腈)/水去過(guò)渡10倍柱體積(150x4.6mm柱子約為30ml，250x4.6mm柱子約為45ml；下同)以上，再用帶鹽的流動(dòng)相去平衡柱子足夠的時(shí)間(直到基線非常平穩(wěn)為止)，之后方可進(jìn)樣分析。
3、無(wú)論您分析何種樣品，都會(huì)由于各種原因樣品中總有部分雜質(zhì)，因此建議您在進(jìn)樣前在柱子前端加接保護(hù)柱以保護(hù)您那昂貴的分析柱，或者用0.2um或 0.45um針頭過(guò)濾器過(guò)濾樣品后方進(jìn)樣分析！
貯液裝置、高壓輸液泵、過(guò)濾器、脫氣裝置等
1. 貯液器：貯液器用于存放溶劑。溶劑必須很純，貯液器材料要耐腐蝕，對(duì)溶劑呈惰性。貯液器應(yīng)配有溶劑過(guò)濾器，以防止活動(dòng)相中的顆粒進(jìn)進(jìn)泵內(nèi)。溶劑過(guò)濾器一般用耐腐蝕的鎳合金制成，空隙大小一般為2mm。
2. 脫氣裝置：脫氣的目的是為了防止活動(dòng)相從高壓柱內(nèi)流出時(shí)，開(kāi)釋出氣泡進(jìn)進(jìn)檢測(cè)器而使噪聲劇增，甚至不能正常檢測(cè)。
3. 高壓輸液泵 高壓輸液泵是高效液相色譜儀的重要部件，是驅(qū)動(dòng)溶劑和樣品通過(guò)色譜柱和檢測(cè)系統(tǒng)的高壓源，其性能好壞直接影響分析結(jié)果的可靠性。
對(duì)高壓泵的基本要求是：
①流量穩(wěn)定；②輸出壓力高，最高輸出壓力為50Mpa；③流量范圍寬，可在0.01～10ml／min范圍任選。④耐酸、堿、緩沖液腐蝕。⑤壓力波動(dòng)小。
2. 梯度洗脫裝置 梯度洗脫是利用兩種或兩種以上的溶劑，按照一定時(shí)間程序連續(xù)或階段地改變配比濃度，以達(dá)到改變活動(dòng)相極性、離子強(qiáng)度或pH值，從而進(jìn)步洗脫能力，改善分離的一種有效方法。當(dāng)一個(gè)樣品混合物的容量因子是范圍很寬，用等度洗脫時(shí)間太長(zhǎng)，且后出的峰形扁平不便檢測(cè)時(shí)，用梯度洗脫可以改善峰形、并縮短分離時(shí)間。HPLC的梯度洗脫與GC的程序升溫相似，可以縮短分析時(shí)間，進(jìn)步分離效果。使所有的峰都處于較佳分離狀態(tài)，而且峰形尖而窄。
二. 進(jìn)樣器
進(jìn)樣器一般要求密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)對(duì)色譜系統(tǒng)的壓力和流量波動(dòng)小，并便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。
高壓進(jìn)樣閥是目前廣泛采用的一種方式。閥的種類(lèi)很多，有六通閥、四通閥，雙路閥等。以六通進(jìn)樣閥較為常用。
三.分離系統(tǒng)
色譜分離系統(tǒng)包括色譜柱、固定相和活動(dòng)相。色譜柱是其核心部分，柱應(yīng)具備耐高壓、耐腐蝕、抗氧化、密封不漏液和柱內(nèi)死體積小、柱效高、柱容量大、分析速度快、柱壽命長(zhǎng)的要求。通常采用優(yōu)質(zhì)不銹鋼管制成。
色譜柱按內(nèi)徑不同可分為常規(guī)柱、快速柱和微量柱三類(lèi)。
常規(guī)分析柱柱長(zhǎng)一般為10~25cm，內(nèi)徑4 ~ 5mm，固定相顆粒直徑為 5 ~ 10 mm。為了保護(hù)分析柱不受污染，一般在分析柱前加一短柱，約數(shù)厘米長(zhǎng)，稱為保護(hù)柱。
?。ㄎ⒘糠治鲋鶅?nèi)徑小于l mm，凝膠色譜往內(nèi)徑3～12 mm，制備往內(nèi)徑較大，可達(dá)25 mm以上。）
四. 檢測(cè)系統(tǒng)
檢測(cè)器的作用是將柱流出物中樣品組成和含量的變化轉(zhuǎn)化為可供檢測(cè)的信號(hào)，常用檢測(cè)器有紫外吸收、熒光、示差折光、化學(xué)發(fā)光等。
高效液相色譜儀是實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的儀器之一，色譜柱的靈敏度是確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的重要原因，那么當(dāng)色譜柱的靈敏度不夠時(shí)，我們?cè)撊绾稳ソ鉀Q呢？應(yīng)該從以下幾個(gè)方面去分析：
1、樣品量不足：解決辦法為增加樣品量
2、樣品未從色譜柱中流出：可根據(jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動(dòng)相或柱子
3、樣品與檢測(cè)器不匹配：根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長(zhǎng)或改換檢測(cè)器
4、檢測(cè)器衰減太多：調(diào)整衰減即可。
5、檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)太大：解決辦法為降低時(shí)間參數(shù)
6、檢測(cè)器池窗污染：解決辦法為清洗池窗。
7、檢測(cè)池中有氣泡：解決辦法為排氣。
8、記錄儀測(cè)壓范圍不當(dāng)：調(diào)整電壓范圍即可。
9、流動(dòng)相流量不合適：調(diào)整流速即可。
10、檢測(cè)器與記錄儀超出校正曲線：解決辦法為檢查記錄儀與檢測(cè)器，重作校正曲線。
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