1、DNA倍體分析
DNA分析是流式細胞儀最初且是現(xiàn)在應(yīng)用廣泛檢測項目。由于惡性細胞DNA含量通常與正常細胞不同,存在異倍體細胞,所以現(xiàn)有很研究評價異倍體細胞與腫瘤惡性度及其預(yù)后的關(guān)系。DNA含量檢測還可提供細胞周期方面的信息,這在細胞生物學(xué)中運用很廣泛。特別地,它可表示出細胞毒性藥物對細胞作用過程。這些DNA檢測還可與細胞表面標志物標記同時進行,這樣在細胞混合培養(yǎng)中,可通常追蹤表達特異標志物的細胞顯示其生長周期情況。所有方法都是基于染料能與核酸起特異的化學(xué)反應(yīng)并發(fā)射出熒光,常用的染料為PI,DAPI。
在該領(lǐng)域Partec公司的 CyFlow PA是一枝獨秀。
2、細胞生存能力實驗
使用Heochest 33342染料與DNA特異性結(jié)合,后因細胞活力不同染料的結(jié)合程度也各異,故可評估細胞的活性度。
3、計數(shù)外周血中檢測網(wǎng)織紅細胞
使用TO染料能夠特異性地與RNA結(jié)合,結(jié)合系數(shù)高達3000,故具有很好的性價比。
4、外周血、骨髓采集物中CD34陽性干細胞計數(shù),臨床上用于骨髓移植前干細胞數(shù)理的測定。使用標準ISHAG方案,需要DNA或其他核染料占用FITC通道,PE標記CD34抗體,PE-CY5標記CD45抗體。
5、交叉淋巴細胞、粒細胞毒實驗
檢測識別供體血清中免疫球蛋白與受體粒細胞之間是否存在反應(yīng)有著重要臨床意義,因為這種反應(yīng)會導(dǎo)致移植后發(fā)熱、移植后肺損傷及免疫性粒細胞缺乏癥。流式細胞儀可檢測全血樣本與血清孵育后粒細胞上結(jié)合的人免疫球蛋白。FITC標記人免疫球蛋白抗體、PE標記粒細胞表面標志物、PE-CY5標記HLA抗體。
6、血小板自身抗體檢測
血小板自身抗體識別人血小板抗原,會引起各種臨床相關(guān)癥狀,如新生兒自免性血小板減少癥、輸血后紫癜、難治性血小板減少。流式細胞可快速準確地檢測血小板自身抗體。FITC標記抗人免疫球蛋白抗體、PE標記識別血小板抗體。
7、移植交叉配型
原細胞毒實驗,主要用于避免移植物超急性排拆反應(yīng)。流式細胞儀用于監(jiān)測T或B細胞是否受到受體血清中免疫球蛋白攻擊,作為HLA配型前的預(yù)實驗。流式細胞儀因其高精確性已成為該領(lǐng)域內(nèi)的金標準。FITC標記抗人免疫球蛋白抗體、PE標記識別T細胞CD3或B細胞CD29抗體。
8、檢測細胞經(jīng)抗原或細胞有絲分裂刺激后活化效應(yīng)淋巴細胞早期活化指標CD69可用來檢測免疫治療效果。流式細胞使用三色分析可監(jiān)測淋巴細胞各亞群活化情況:FITC標記的CD3抗體、PE標記的CD8抗體、PE-CY5標記的CD69抗體。
9、細胞增殖狀態(tài)檢測
核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量細胞增殖分裂狀況,在評估腫瘤預(yù)后有重要意義。為些標志物的檢測一般同細胞表面標志物同時檢測。FITC標記PCNA或Ki67或BrdUrd,PE或(并)PE-CY5標記細胞表面標志物。
10、染色體分析
流式細胞儀染色分析運用兩種特異性染料:Hoechest33258與核苷酸AT結(jié)合;Chromomycin A3與GC相結(jié)合。從而在雙參數(shù)坐標上根據(jù)染色體ATCG含量的不同識別各種染色體。平時進行的染色體分析耗時且需要操作者極具經(jīng)驗,而用流式細胞儀時可快速地識別出異常染色體,如加配分選系統(tǒng)可將這些異常染色體分選出來作進一步分析。
流式細胞儀是進行流式細胞分析的儀器,集電子、計算機、激光、流體理論于一體,被譽為試驗室的“CT”。
流式細胞術(shù)(Flow CytoMeter, FCM)是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段;
它可高速分析上萬個細胞,并能同時從一個細胞中測得多個參數(shù),與傳統(tǒng)熒光鏡檢查相比;
具有速度快、精度高、準確性好等優(yōu)點,成為當代zui先進的細胞定量分析技術(shù)。
工作原理
將待測細胞染色后制成單細胞懸液。
用一定壓力將待測樣品壓入流動室,不含細胞的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出,鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度;
這樣,鞘液就能夠包繞著樣品高速流動,組成一個圓形的流束,待測細胞在鞘液的包被下單行排列,依次通過檢測區(qū)域。
流式細胞儀通常以激光作為發(fā)光源。
經(jīng)過聚焦整形后的光束,垂直照射在樣品流上,被熒光染色的細胞在激光束的照射下,產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。
這兩種信號同時被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管接收。
光散射信號在前向小角度進行檢測,這種信號基本上反映了細胞體積的大小;熒光信號的接受方向與激光束垂直;
經(jīng)過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離,形成多個不同波長的熒光信號。
這些熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內(nèi)物質(zhì)的濃度;
經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號,再通過A/D轉(zhuǎn)換器,將連續(xù)的電信號轉(zhuǎn)換為可被計算機識別的數(shù)字信號。
計算機把所測量到的各種信號進行計算機處理,將分析結(jié)果顯示在計算機屏幕上,液可以打印出來;
還可以數(shù)據(jù)文件的形式存儲在硬盤上以備日后的查詢或進一步分析。
檢測數(shù)據(jù)的顯示視測量參數(shù)的不同由多種形式可供選擇。
單參數(shù)數(shù)據(jù)以直方圖的形式表達,其X軸為測量強度,Y軸為細胞數(shù)目。
一般來說,流式細胞儀坐標軸的分辨率有512或1024通道數(shù),這視其模數(shù)轉(zhuǎn)換器的分辨率而定。
對于雙參數(shù)或多參數(shù)數(shù)據(jù),既可以單獨顯示每個參數(shù)的直方圖;
也可以選擇二維的三點圖、等高線圖、灰度圖或三維立體視圖。
細胞的分選是通過分離含有單細胞的液滴而實現(xiàn)的。
在流動室的噴口上配有一個超高頻電晶體,充電后振動;
使噴出的液流斷裂為均勻的液滴,待測定細胞就分散在這些液滴之中。
將這些液滴充以正負不同的電荷,當液滴流經(jīng)帶有幾千伏特的偏轉(zhuǎn)板時;
在高壓電場的作用下偏轉(zhuǎn),落入各自的收集容器中,不予充電的液滴落入中間的廢液容器,從而實現(xiàn)細胞的分離。
下一篇:恒溫水浴的操作使用及注意事項