在我們平常的工作當中，液相色譜柱的正確使用和維護十分重要，液相色譜柱使用是否得當，直接影響液相色譜柱的壽命，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。
在液相色譜操作過程中，我們需要了解下面的問題，方便維護液相色譜柱。
1.柱子在裝卸、更換時，動作要輕，接頭擰緊要適度。必須防止較強的機械振動，以免柱床產(chǎn)生空隙。
2.如果儀器用來做常規(guī)分析，樣品種類有限，但分析次數(shù)多，則不妨為每一類常規(guī)分析配置一根專用柱，這樣有助于延長柱子的壽命。
3.避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使液相色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉(zhuǎn)動不能過緩。
4.應逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?/p>
5.如使用柱溫控制裝置時，應注意在通人流動相后才能升溫。
6.一般說來液相色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效。
7.選擇使用適宜的流動相，以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一個預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。
8.避免將基質(zhì)復雜的樣品尤其是生物樣品直接注人柱內(nèi)，需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一個保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經(jīng)常更換。
9.經(jīng)常用強溶劑沖洗液相色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進行清洗時，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50-75mL。
10.保存液相色譜柱時應將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時間。
11.液相色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時應更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M行清洗；另一種可能是大分子進人柱內(nèi)，使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。
12.在完成分離分析工作之后，不能馬上就關機，需及時對色譜分析系統(tǒng)進行沖洗，一般0.5h以上，以除去液相色譜柱內(nèi)的雜質(zhì)。
色譜柱是高效液相色譜儀最主要的部件，被測物質(zhì)能否被很好的分離和測定，色譜柱的性能起著決定性的作用。因此，在日常工作中，應特別注意色譜柱的正確使用和維修保養(yǎng)，以延長色譜柱的使用壽命。
1、使用預柱和保護柱
預柱(pre-column)安裝于泵和進樣器之間，它給色譜柱中的流動相提供了完全的平衡，并防止了對柱填料有破壞作用的組分或污染物進入色譜柱。保護柱(guardcolumn)可以阻擋能夠牢固地吸附于色譜柱上的組分進入色譜柱，保護柱應與色譜柱的填料相同。預柱和保護柱可以經(jīng)常更換，而不需要經(jīng)常更換色譜柱，這就延長了色譜柱的使用壽命。
2、防止氣體進入
有些色譜柱(如凝膠柱)是不允許氣泡進入的，否則將會使柱效降低甚至形成微小的難以驅(qū)除的氣室。因此，為了防止氣泡進入色譜柱，一定要使用經(jīng)過脫氣的流動相，并且要嚴格按照下列步驟來安裝色譜柱。a、拆卸下色譜柱入口處的密封螺絲，觀察是否有溶劑滲出；b、如有溶劑滲出，即可將色譜柱接到管路上，以避免氣泡的進入；c、如無溶劑滲出時，表明色譜柱的此端已經(jīng)進去空氣了，此時，可將色譜柱的出口端接到進樣閥上，以流動相來反方向沖洗色譜柱，以便將柱內(nèi)的空氣排除?？梢砸?、2ml/min的小流量來沖色譜柱，如果溶劑的流速太快或者是壓力突然的上升都將會導致柱性能的降低；d、如果流出的溶劑里不含有氣泡，說明柱內(nèi)的氣體已經(jīng)被排出了，再將色譜柱以正確的方向接好，這樣氣泡就進不到色譜柱里面了。
3、清洗
為了不使被測物質(zhì)和雜質(zhì)停留在色譜柱中，在每次的樣品分析工作完成之后，都應及時地清洗色譜柱。首先要用對被測樣品洗脫能力強的溶劑來洗脫色譜柱，以分析工作中常用的反相色譜分析法為例，因其先流出的物質(zhì)是極性大的物質(zhì)，此時應用100%的甲醇或使用異丙純、四氫呋喃等極性稍弱的溶劑將吸附在柱內(nèi)的極性小的物質(zhì)洗脫下來，洗脫液的用量一般為柱體積的20倍即可。如果流動相是緩沖溶液，則應先用蒸餾水來沖洗色譜柱，以沖掉柱內(nèi)的鹽，然后再用合適的溶劑來沖洗。
凝膠濾過色譜法(GelFiltrationChromatography)中所使用的凝膠柱常用緩沖溶液做流動相，用完之后當然要用蒸餾水來沖洗。如果是連續(xù)操作，可以將緩沖溶液置于柱內(nèi)過夜，但可以是維持小流速(＜0、5ml/min)以防止緩沖鹽的析出，如果流動相中含有鹵化物，即使是停一夜，也必須要用蒸餾水將色譜柱沖洗干凈，以防止它們對柱體的腐蝕。
4、存放
如果色譜柱暫時不用，存放時要注意以下幾點：
a、幾天之內(nèi)的短期放置，應先用溶劑沖洗好色譜柱(如凝膠柱則用蒸餾水來沖洗)，再把色譜柱的兩頭用密封螺絲密封好即可。
b、如果色譜柱長期不用，僅用上述方法來處理就不行了，這時應使用色譜柱使用說明書中所指明的溶劑來充滿色譜柱，反相柱一般使用甲醇，正相柱則可用正已烷或庚烷，而凝膠柱則不能用水了，因柱內(nèi)如果有微生物的生長則會使柱效降低，此時應用0、05%的NaNs水溶液(防腐劑)來沖洗色譜柱，再將色譜柱封嚴。色譜柱長期放置時，一定要將色譜柱的兩端封嚴，以防止由于溶劑揮發(fā)而造成的柱填料干縮現(xiàn)象，因這可導致柱效的嚴重降低。
c、色譜柱應貯存在室溫下，如果放置于0℃以下的環(huán)境里，柱內(nèi)就會結冰，這也將導致柱效的降低。
任何顆粒物進進高效液相色譜儀后都會在柱子進口端被篩板擋住，最后的結果是將柱子堵塞，表現(xiàn)出的特征是系統(tǒng)壓力增加并使色譜峰變形。因此，要采取各種預防措施，包括操縱步驟和商品儀器自身的各種過濾設計，努力防止或減少顆粒物進進高效液相色譜儀中，從而延長儀器和色譜柱的使用壽命，并進步數(shù)據(jù)的可靠性。在高效液相色譜儀中，顆粒物的主要來源有三個途徑：活動相、被測樣品和儀器系統(tǒng)部件的磨損物。
1、被測樣品
液相系統(tǒng)中的第二個顆粒物來源是被測樣品。一些實驗室在將他們的樣品放置在自動進樣器盤（或手動進樣）以前，所有樣品都先通過一個0.45μm針筒式過濾器過濾。這是一個有效除往被測樣品中顆粒物的方法。但是這個過程也有一點需要關注：你使用了針筒式過濾器就不可能100%得到通過過濾器的被測樣品，總會有或多或少的丟失。丟失來自這樣幾方面：過濾器濾膜的吸附、過濾器濾出的顆粒物上的吸附、針筒式濾膜過濾器與針筒連接處的滲漏等。假如有丟失，過濾后液體中被測物的含量或濃度與原基本樣液的含量或濃度還相同嗎？這個題目一般需要通過實驗確認。確認這步是要增加工作量和用度的。過濾器的使用是一種消耗，每個過濾器的價格從幾元到十幾元。但在做食品中殘留物分析時，由于基質(zhì)大多比較復雜，所以過濾這步已成為不可或缺的一步。在實際分析工作中，一般檢測每一組樣品會帶一個外標、一個添加回收或是質(zhì)控樣品，所以，只要終極檢測時得到的信噪比能滿足檢出限要求，可將這步視為系統(tǒng)誤差而忽略。
2、活動相
假如活動相均由高效液相色譜級溶劑組成，活動相沒有必要過濾。這是由于高效液相色譜級的有機溶劑，例如乙腈、甲醇等，在制造的工藝過程中都已經(jīng)過了0.2μm微孔濾膜過濾。同樣的，無論你是買的高效液相色譜儀HPLC級的水還是在實驗室使用超純水凈化系統(tǒng)制備的水，最后一步也是通過0.2μm微孔濾膜。然而，假如有任何一種緩沖液中加進了固體物，例如磷酸鹽，活動相過濾將是必要的一個步驟。固然緩沖鹽可能是可溶解的、高純的，但它還是可能含有顆粒物質(zhì)，例如在蓋試劑瓶的塑料內(nèi)蓋時，塑料瓶蓋子與瓶口邊沿擠壓就會產(chǎn)生塑料顆粒。在這種情況下，添加的一種固體物可能完全溶解了，但是少量雜質(zhì)顆粒存在于活動相中成為殘渣。
活動相通過0.45μm微孔濾膜過濾對于從活動相中除往所有顆粒物是一個有效方法。0.2μm微孔濾膜也可以用，但是它們就這個應用而言并不比0.45μm微孔濾膜更有效，而且它的過濾速度會更慢，特別是當實驗室使用的試劑和水的質(zhì)量不太好時。建議實驗室在編寫制定他們活動相制備標準操縱程序（SOPs）時規(guī)定，可以鑒戒國際上同類實驗室的規(guī)定，即：
活動相制備僅采用HPLC級液體時不需要過濾，反之所有活動相組成在使用前必須過濾。
在連接儲液瓶和泵的輸液管的末端進口采用下沉式過濾器（常見材質(zhì)有熔融玻璃砂芯濾板和微孔金屬的兩種）也是很重要的。這個過濾器的規(guī)格為≥10μm的微孔物質(zhì)，所以它不能取代活動相過濾步驟，但是它能除往系統(tǒng)中的塵土并保證儲液瓶、輸液管使用的可靠性。
3、儀器系統(tǒng)部件的磨損物
最后，在高效液相色譜儀HPLC系統(tǒng)中顆粒物的另一個主要來源是輸液泵密封墊和進樣閥旋轉(zhuǎn)軸的磨損。關于輸液泵密封墊的磨損更換有兩種不同建議。
第一種建議以為，在一般實驗室中輸液泵密封墊通常使用壽命為六個月到一年，因此建議半年或一年更換這些密封墊，實驗室應基于上述觀點制定定期預防性維護計劃。該觀點以為：與輸液泵密封墊顆粒堵塞柱子而更換新柱子的用度相比，更換密封墊的用度低些。一些輸液泵有玻璃砂芯或篩網(wǎng)，可在流路中濾掉從泵密封墊磨損下來的顆粒物，防止這些顆粒物隨活動相流至柱頭。若有這種裝置應查閱輸液泵操縱手冊，查看推薦的這種過濾器清洗或更換的間隔。
另一種建議則以為，原裝密封墊的密封效果可以，更換以后輕易引起活動相滲漏。所以，只要不漏液就不要輕易更換密封墊。
兩種說法都有其道理，具體如何操縱，建議與儀器公司工程師溝通，各公司的儀器還是有些不同的。
自動進樣器旋轉(zhuǎn)軸的密封隨著使用時間也會磨損，但是在我的經(jīng)驗中，即便是高負荷的運轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)軸密封墊也可以使用幾年。假如你的自動進樣器系統(tǒng)有計數(shù)進樣閥轉(zhuǎn)動次數(shù)的功能，你可以設定一個警鈴當預設閥轉(zhuǎn)動次數(shù)已達到時提醒你。曾有一種說法，進樣器較多轉(zhuǎn)動20,000次，這僅僅是進樣10000個；但這似乎不是實驗室涉及的常規(guī)樣品分析使用壽命，它們的實際使用壽命會更長。旋轉(zhuǎn)軸密封磨損后會滲液，比較明顯的特征是同一樣品多次進樣后，峰面積值差別比較大（RSD>?5%）。當然，輸液泵的密封墊和旋轉(zhuǎn)軸的密封墊磨損將增加更多研磨物在活動相中，加速對這些部件的損傷。此外，假如你日常運行的活動相有緩沖鹽，如磷酸緩沖鹽，密封墊的磨損會更快。
無論顆粒物源于何物，實驗時都要將其除往。推薦在HPLC系統(tǒng)中采用一個0.45或0.5μm的在線多孔過濾器，接在自動進樣器和柱子之間，即使已使用了保護柱。這個在線過濾器將成為擋板代替柱頭的濾板，而且如采用一個玻璃砂芯濾板，既便宜，更換又方便（幾分鐘就可更換）。若采用在線過濾，高效液相色譜儀檢測每批樣品開始前記錄下壓力值，當壓力上升一定值，例如25%或增加500psi，應該更換玻璃砂芯濾板了，更換以后沖洗幾分鐘系統(tǒng)將恢復到原來的壓力值。
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