超高效液相色譜儀與普通高效液相色譜原理相同,因此,在使用中應(yīng)注意的問(wèn)題是相同的。
要想成為一個(gè)合格的色譜分析者,良好的實(shí)驗(yàn)規(guī)范與習(xí)慣是非常必要的。一些小細(xì)節(jié)的失誤或忽視一些簡(jiǎn)單的問(wèn)題往往導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想或損壞儀器,從而造成重大的損失。
而在使用中從最初的樣品準(zhǔn)備開(kāi)始也有細(xì)節(jié)部分需要注意:
在保證目標(biāo)物回收率的情況下,盡量除去樣品中其它雜質(zhì)。
選用合適的濾膜(濾膜有水溶型、脂溶型、通用型、超高效液相色譜用0.2?m)過(guò)濾樣品,確保樣品中不含固體顆粒??梢允褂门c初始流動(dòng)相組成相同的溶劑溶解樣品,在反相分析時(shí),用比流動(dòng)相極性更低的有機(jī)相;在用正相分析時(shí),如在親水色譜分析時(shí),溶解樣品的一定是高極性有機(jī)相,否則,會(huì)引起色譜峰的變形,比如保留時(shí)間提前、雙峰等。
在保證靈敏度與準(zhǔn)確度的前提下,進(jìn)樣量要盡量小。
高效液相色譜儀的衍生化技術(shù)衍是指將用通常檢測(cè)方法不能直接檢測(cè)或檢測(cè)靈敏度比較低的物質(zhì)與某種試劑(即衍生化試劑)反應(yīng),使之生成易于檢測(cè)的化合物的過(guò)程。按衍生化方法可分為柱前衍生化和柱后衍生化。
一、柱前衍生化:
柱前衍生化是指將被測(cè)物轉(zhuǎn)變成可檢測(cè)的衍生物后,再通過(guò)色譜柱分離。這種衍生化可以是在線(xiàn)衍生化,即將被測(cè)物和衍生化試劑分別通過(guò)兩個(gè)輸液泵送到混合器里混合并使之立即反應(yīng)完成,隨之進(jìn)入色譜柱;也可以先將被測(cè)物和衍生化試劑反應(yīng),再將衍生物作為樣品進(jìn)樣;也可以在流動(dòng)相中加入衍生化試劑,進(jìn)樣后,讓被測(cè)物與流動(dòng)相直接發(fā)生衍生化反應(yīng)。
二、柱后衍生化:
柱后衍生化是指先將被測(cè)物分離,再將從色譜柱流出的溶液與衍生化試劑在線(xiàn)混合,生成可檢測(cè)的衍生物,然后導(dǎo)入檢測(cè)器。按生成衍生物的類(lèi)型可分為紫外可見(jiàn)光衍生化、熒光衍生化、拉曼衍生化和電化學(xué)衍生化等。
1、紫外可光見(jiàn)衍生化:
?。?)紫外衍生化是指將紫外吸收弱或無(wú)紫外吸收的有機(jī)化合物與帶有紫外吸收基團(tuán)的衍生化試劑反應(yīng),使之生成可以用紫外檢測(cè)的化合物。如胺類(lèi)化合物容易與鹵代烴、羰基、?;?lèi)衍生試劑反應(yīng)。
?。?)可見(jiàn)光衍生化有兩個(gè)主要的應(yīng)用:一是用于過(guò)渡金屬離子的檢測(cè),將過(guò)渡金屬離子與顯色劑反應(yīng),生成有色的配合物、螯合物或離子締合物后用可見(jiàn)光檢測(cè);二是用于有機(jī)離子的檢測(cè),在流動(dòng)相中加入被測(cè)離子的反離子,使之形成有色的離子對(duì)化合物后,分離檢測(cè)。
2、熒光衍生化:
熒光衍生化是指將被測(cè)物與熒光衍生化試劑反應(yīng)后生成具有熒光的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。有的熒光衍生化試劑本身沒(méi)有熒光,而其衍生物卻有很強(qiáng)的熒光。衍生化技術(shù)不僅使高效液相色譜儀分析體系復(fù)雜化,而且需要消耗時(shí)間,增加分析成本,有的衍生化反應(yīng)還需要控制嚴(yán)格的反應(yīng)條件。因此,只有在找不到方便而靈敏的檢測(cè)方法或?yàn)榱颂岣叻蛛x檢測(cè)的選擇性時(shí),才考慮用衍生化技術(shù)。
高效液相色譜儀分析中進(jìn)樣基線(xiàn)很好,保留時(shí)間能鎖定,壓力也穩(wěn)定,但是峰面積差別很大,大概有2倍的差別,這種情況出現(xiàn)的原因可能是多方面的,建議采用以下方法解決:
1、調(diào)換一根新色譜柱,如果情況一樣,則排除柱子的原因。
2、將在線(xiàn)過(guò)濾器拆下,用超聲波清洗,如果結(jié)果一樣,說(shuō)明與在線(xiàn)過(guò)濾器無(wú)關(guān)。
3、考慮是不是進(jìn)樣閥有問(wèn)題或者定量環(huán)堵。建議多進(jìn)幾針樣品,看是否有規(guī)律,如果沒(méi)有規(guī)律,應(yīng)檢查一下進(jìn)樣器的其他部位,如果是進(jìn)樣器系統(tǒng)出現(xiàn)問(wèn)題,應(yīng)盡快解決之。
4、對(duì)進(jìn)樣器清洗一下,清洗干凈后先進(jìn)一針空白,再進(jìn)樣,看看結(jié)果如何,如果有明顯減少,那可能是進(jìn)樣器污染,有樣品殘留在進(jìn)樣閥體內(nèi),在切換的過(guò)程中被流動(dòng)相帶入色譜柱。
5、考慮樣品溶液是否均勻。建議同一個(gè)濃度連續(xù)進(jìn)樣5次,看一下結(jié)果如何變化,有沒(méi)有規(guī)律;如果是樣品溶液不均勻,可以再攪拌一下。
6、考慮光源是不是正常。
7、考慮濃度是否在線(xiàn)性范圍內(nèi)。有時(shí)候定量時(shí)濃度太高或太低都會(huì)產(chǎn)生較大的分析誤差。
8、考慮取樣方式是否正確,每次取樣后是否對(duì)針頭外面的附著液進(jìn)行清除。
9、高效液相色譜儀的計(jì)算機(jī)軟件編制可能存在問(wèn)題。對(duì)比可以適當(dāng)改變軟件。