熒光的原理是某些物質(zhì)會在高強度的短波長光線照射下，會發(fā)出波長稍長的發(fā)射光（熒光）。而我們一般都是觀察被激發(fā)熒光基團所發(fā)射出來的波長稍長的發(fā)射光（熒光）。

    但是激發(fā)的光會很強，所以我們就需要把激發(fā)的光全部濾去，這樣才可以看到熒光基團的發(fā)射光（熒光）。

    熒光顯微鏡一般都用高強度的汞燈做激發(fā)光源。使用濾色片把不需要的光濾去，只留下激發(fā)熒光集團的高強度很純的光線。這個單色的光線通過物鏡照射到樣本上之后，樣本會被激發(fā)出發(fā)射光（熒光），熒光和激發(fā)光都會沿著物鏡光路返回，這樣的話，就需要用一個二相色鏡把激發(fā)光濾去，只讓我們需要看到的熒光透過。

    這個熒光沿著顯微鏡的光路最后到達目鏡下，然后進入我們的眼睛，我們就可以看到熒光基團所發(fā)出來的熒光了。

    熒光顯微鏡的預(yù)檢查和調(diào)節(jié)：

    (1)每次進行熒光觀測前，必須例行檢查熒光裝置的燈絲對中、光路對焦、孔徑光闌、視場光闌設(shè)置等狀況。

    (2)所需要的熒光激發(fā)/發(fā)射濾光片組件是否已裝在轉(zhuǎn)換器中，熒光顯微鏡物鏡配置是否得當(dāng)，除去物鏡前透鏡的油漬和灰塵。

    (3)如同時進行透射光相差觀察，要檢查聚光鏡對中心及相差環(huán)與物鏡相反的共軛情況。

    (4)檢查樣品載體(載玻片、蓋玻片和其他器皿)有否掛有液體、灰塵，厚度是否在物鏡標(biāo)定的工作距離范圍內(nèi)。切片樣品不能太厚，約≤10μm為宜。

    (5)因照明光源含有紫外線，在載物臺前上方放一塊棕色遮光板，以防紫外線損傷視網(wǎng)膜。

    (6)電壓不穩(wěn)會降低高壓汞燈的使用壽命，光源電源加配穩(wěn)壓器。

    (7)為延長汞燈壽命，在開啟后15min方可關(guān)閉；汞燈熒光電源一旦關(guān)閉，再次啟動至少需等待10min，以使水銀蒸汽冷卻復(fù)至原態(tài)，否則會影響燈的壽命。

    熒光顯微鏡的像觀察：

    (1)在開啟熒光燈源后約5～10min激發(fā)光強度趨于穩(wěn)定，裝載樣品進行觀察；為防止在調(diào)焦和尋找物像過程中過度激發(fā)光照會造成樣品熒光淬滅，先通過縮小熒光顯微鏡的孔徑光闌或加ND濾光片將激發(fā)光調(diào)節(jié)到適度強度，有規(guī)律地移動樣品臺，待確定鏡像后，在調(diào)節(jié)到熒光狀態(tài)用于拍攝記錄。

    (2)鏡像質(zhì)量不佳的調(diào)整。排除樣品制備因素外，可進行的必要調(diào)節(jié)措施是：

    ①排除成像光路中的遮光或限光器件，如DIC附件、ND濾光片等。

    ②重新調(diào)節(jié)熒光顯微鏡的收光器對焦和孔徑光闌大小。

    ③細(xì)心調(diào)節(jié)熒光顯微鏡物鏡覆蓋差校正環(huán)。

    熒光顯微鏡的應(yīng)用要點

    熒光顯微鏡是利用“光化熒光”成像，如果所選激發(fā)波長在肉眼所看不見的近紫外光區(qū)(320～400nm)，熒光的發(fā)射光譜也較普通光鏡光源的平均波長短，光學(xué)分辨率提高。高能量的光子與電子碰撞，使得電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)的電子很不穩(wěn)定，會重新回落到基態(tài)，這個過程中會消耗部分熱能，并發(fā)出新的光子。新的光子能量比起初的光子能量低，因此波長更長。由于新的光子波長區(qū)別于入射光的光子波長，通過一定的光學(xué)處理方法將兩束不同波長的光分開，從而使我們只看到發(fā)射出來的新光子（熒光信號），也就是熒光顯微鏡看到的熒光圖像。