除了核酸濃度,分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度,如A260/A280的比值,用于評估樣品的純度,因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0,表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。A230表示樣品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品,A320一般是0。
蛋白質的直接定量(UV法)
這種方法是在280nm波長,直接測試蛋白。選擇Warburg公式,光度計可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應的換算方法,將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程非常簡單,先測試空白液,然后直接測試蛋白質。由于緩沖液中存在一些雜質,一般要消除320nm的“背景”信息,設定此功能“開”。與測試核酸類似,要求A280的吸光值至少大于0.1A,較佳的線性范圍在1.0-1.5之間。實驗中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時,發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個正常的現(xiàn)象。事實上,只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%,表明結果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因為Warburg公式吸光值換算成濃度,乘以一定的系數(shù),只要吸光值有少許改變,濃度就會被放大,從而顯得結果很不穩(wěn)定。蛋白質直接定量方法,適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對于比色法來說,速度快,操作簡單;但是容易受到平行物質的干擾,如DNA的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較高。
比色法蛋白質定量
蛋白質通常是多種蛋白質的混合物,比色法測定的基礎是蛋白質構成成分:氨基酸(如酪氨酸,絲氨酸)與外加的顯色基團或者染料反應,產(chǎn)生有色物質。有色物質的濃度與蛋白質反應的氨基酸數(shù)目直接相關,從而反應蛋白質濃度。
一.光源部分:
?。?)故障:鎢燈不亮;
原因:鎢燈燈絲燒斷(此種原因幾率最高);
檢查:鎢燈兩端有工作電壓,但燈不亮;取下鎢燈用萬用表電阻檔檢測。
處置:更換新鎢燈;
?。?)故障:氘燈不亮;
原因:氘燈起輝電路故障;
檢查:氘燈在起輝的過程中,一般是燈絲先要預熱數(shù)秒鐘,然后燈的陽極與陰極間才可起輝放電,如果燈在起輝的開始瞬間燈內(nèi)閃動一下或連續(xù)閃動,并且更換新的氘燈后依然如此,有可能是起輝電路有故障,燈電流調(diào)整用的大功率晶體管損壞的幾率最大。
處置:需要專業(yè)人士修理;
二.信號部分:
?。?)故障:沒有任何檢測信號輸出;
原因:沒有任何光束照射到樣品室內(nèi);
檢查:將波長設定為530nm,狹縫盡量開到最寬檔位,在黑暗的環(huán)境下用一張白紙放在樣品室光窗出口處,觀察白紙上有無綠光斑影像;
處置:檢查光源鏡是否轉到位,雙光束的切光電機是否轉動了(耳朵可以聽見電機轉動的聲音);
?。?)故障:樣品室內(nèi)無任何物品的情況下,全波長范圍內(nèi)基線噪聲大;
原因:光源鏡位置不正確、石英窗表面被濺射上樣品;
檢查:觀察光源是否照射到入射狹縫的中央?石英窗上有無污染物?
處置:重新調(diào)整光源鏡的位置,用乙醇清洗石英窗;
(3)故障:樣品室內(nèi)無任何物品的情況下,僅僅是紫外區(qū)的基線噪聲大;
原因:氘燈老化、光學系統(tǒng)的反光鏡表面劣化、濾光片出現(xiàn)結晶物;
檢查:可見區(qū)的基線較為平坦,斷電后打開儀器的單色器及上蓋,肉眼可以觀察到光柵、反光鏡表面有一層白色霧狀物覆蓋在上面;如果光學系統(tǒng)正常,最大的可能是氘燈老化,可以通過能量檢查或更換新燈方法加以判斷;
處置:更換氘燈、用火棉膠粘取鏡面上的污物或用研磨膏研磨濾光片(注意:此種技巧需要有一定維修經(jīng)驗者來實施);
?。?)故障:樣品室放入空白后做基線記憶,噪聲較大,紫外區(qū)尤甚;
原因:比色皿表面或內(nèi)壁被污染、使用了玻璃比色皿或空白樣品對紫外光譜的吸收太強烈,使放大器超出了校正范圍;
檢查:將波長設定為250nm,先在不放任何物品的狀態(tài)下調(diào)零,然后將空比色皿插入樣品道一側,此時吸光值應小于0.07Abs;如果大于此值,有可能是比色皿不干凈或使用了玻璃比色皿;同樣方法也可判斷空白溶液的吸光值大小;
處置:清洗比色皿,更換空白溶液;
?。?)故障:吸光值結果出現(xiàn)負值(常見);
原因:沒做空白記憶、樣品的吸光值小于空白參比液;
檢查:將參比液與樣品液調(diào)換位置便知;
處置:做空白記憶、調(diào)換參比液或用參比液配置樣品溶液;
?。?)故障:樣品信號重現(xiàn)性不良;
原因:排除本身的原因外,最大的可能是樣品溶液不均勻所致;在簡易的單光束儀器中,樣品池架一般為推拉式的,有時重復推拉不在同一個位置上;
檢查:更換一種穩(wěn)定的試樣判定;
處置:采取正確的試樣配置手段;修理推拉式樣品架的定位碰珠;
?。?)故障:做基線掃描或樣品掃描時,基線或信號有一個大的負脈沖;
原因:掃描速度設置得過快,信號在讀取時,誤將濾光片或光源鏡的切換當做信號讀取了;
檢查:改變掃描速度;
?。?)故障:做基線掃描或樣品掃描時,基線或信號有一個長時間段的負值或滿屏大噪聲;
原因:濾光片飼服電機“失步”,造成檔位錯位,國產(chǎn)電機尤甚;
檢查:重新開機有可能回復,或打開單色器對照波長與濾光片的相對位置來檢查(注意:打開單色器時要保護檢測器不被強光刺激);
處置:更換飼服電機;
(9)故障:樣品出峰位置不對;
原因:波長傳動機構產(chǎn)生位移;
檢查:通過氘燈的656.1nm的特征譜線來判斷波長是否準確;
處置:對于高檔儀器而言處理手段相對簡單,使用儀器固有的自動校正功能即可;而對于相對簡單的儀器,這種調(diào)整則需要專業(yè)人員來進行了;
(10)故障:信號的分辨率不夠,具體表現(xiàn)是:本應疊加在某一大峰上的小峰無法觀察到;
原因:狹縫設置過窄而掃描速度過快,造成檢測器響應速度跟不上,從而失去應測到的信號;按常理,一定的狹縫寬度要對應一定范圍的掃描速度;或者狹縫設置得過寬,使儀器的分辨率下降,將小峰融合在大峰里了。
檢查:放慢掃描速度看一看或將狹縫設窄;
處置:將掃描速度、狹縫寬窄、時間常數(shù)三者擬合成一個優(yōu)化的條件;
?。?1)故障:當儀器波長固定在某個波長下時,吸光值信號上下擺動,特別是測量模式轉換為按鍵開關式的簡易儀器;
原因:開關觸點因長期氧化所致造成接觸不良;
檢查:用手加重力量按琴鍵時,吸光值隨之變化;
處置:用金屬活化劑清洗按鍵觸點即可;
?。?2)故障:儀器零點飄忽不定,主要反映在簡易儀器上;
原因:在簡易儀器中,零點往往是通過電位器來調(diào)整,這種電位器一般是炭膜電阻制作的,使用久了往往造成接觸不良;
處置:更換電位器;
還有一點補充一下,如果是PC連接UV時,同志們一定注意接口板別不小心被擊穿,一定要關機后拔插.若可見部分穩(wěn)定性不好,有可能是鎢燈的供電電壓不穩(wěn),一般鎢燈電源是穩(wěn)壓電路。
雙光束分光光度計成功實現(xiàn)了高精度和高可靠性測量的嚴格要求,可滿足各種應用的要求,可用在生物研究、生物工業(yè)、藥物分析、制藥、教學研究、環(huán)保、食品衛(wèi)生、臨床檢驗、衛(wèi)生防疫等領域。
雙光束分光光度計的特點:
1、測量數(shù)據(jù)可通過打印機輸出,具有USB接口
2、可斷電保存測量參數(shù)和數(shù)據(jù),方便用戶使用
3、寬廣的波長范圍,可滿足各個領域對波長范圍的要求
4、全自動的設計理念,實現(xiàn)了zui簡單的測量手段
5、大規(guī)模集成電路的設計大大提高了系統(tǒng)的擴展性和可靠性
6、改良優(yōu)化的光路設計、進口光源和接收器造就了系統(tǒng)高性能和高可靠性
7、豐富的測量方法,具有波長掃描、時間掃描、多波長測定、多階導數(shù)測定(選)、雙波長、三波長(選)DNA蛋白質測量(選)等多種測量方法,可滿足不同測量的要求,并可在6英寸大屏幕上直接顯示
8、根據(jù)用戶的要求可選配單孔架、手動四連架、手動八連架、自動八連架、玻璃支架、試管架、1cm比色架、5cm比色架、10cm比色架等
9、可通過PC控制實現(xiàn)更精確和靈活的測量,可滿足不同用戶的需求。