紫外及可見光分光光度計(jì)的可測波長范圍為200一1000 nm,也有波長范圍為200- 400 nm的紫外分光光度計(jì),但前者較為普遍。紫外及可見光分光光度計(jì)的構(gòu)造原理與可見光分光光度計(jì)(如721型分光光度計(jì))相似。由于玻璃吸收紫外光,因此單色器要用石英棱鏡或光柵。 (一)光(light source) 有鎢絲燈及氫燈(或氛燈)兩種??梢姽鈪^(qū)(360一1000 nm)使用鎢絲燈;紫外光區(qū) (200一360 nm)則用氫燈或氛燈。 (二)吸收池(absorption cell) 由于玻璃吸收紫外光.吸收池要用石英材質(zhì)。 (三)檢瀏器(detector) 檢側(cè)器使用兩只光電管,一為氧化艷光電管,用于625一1000 nm波長范圍;另一只是銻艷光電管,用于200一625 nm波長范圍。光電倍增管亦為常用的檢測器,其靈敏度比一般的光電管高2個數(shù)量級。 紫外及可見光分光光度計(jì)分單光束和雙光束型。單光束型儀器使用前一般需要預(yù)熱以使儀器穩(wěn)定,缺點(diǎn)是難以消除與補(bǔ)償由于光源與電子測量系統(tǒng)不穩(wěn)定等所引致的誤差。雙光束型儀器能夠消除與補(bǔ)償由于光源、電子測量系統(tǒng)不穩(wěn)定等所引致的誤差,所以其測盤的精確度就提高了。 其工作原理可描述為:由光源(鎢絲燈氘燈,根據(jù)波長而變換使用)發(fā)出的光經(jīng)人口狹縫及反射鏡反射至石英棱鏡或光柵,色散后經(jīng)過出口狹縫而得到所需波長的單色光束。然后由反射鏡反射至由馬達(dá)轉(zhuǎn)動的調(diào)制板及扇形鏡上。當(dāng)調(diào)制板以一定轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)時,時而使光束通過,時而擋住光束,因而調(diào)制成一定頻率的交變光束。之后扇形鏡在旋轉(zhuǎn)時,將此交變光束交替地投射到參比溶液(空白溶液)及試樣溶液上,后面的光電倍增管接受通過參比溶液及為試樣溶液所減弱的交變光通量,并使之轉(zhuǎn)變?yōu)闇y量信號。此信號經(jīng)放大并用解調(diào)器分離及整流,然后以電位器自動平衡此兩直流信號的比率,并依照記錄器記錄得到吸收曲線。
由于分光光度計(jì)是一種常用的實(shí)驗(yàn)室分析儀器,款式和價格都是多樣化的,因此如何選擇一款合適的分光光度計(jì)就顯得尤為重要了。下面簡單說一下如何選擇分光光度計(jì)。
一、選擇可滿足使用者長期分析要求的儀器即可:
盡管分光光度計(jì)種類繁多,但不外乎:簡易型、中檔型和高檔型三大類;
(1)簡易型儀器及其特點(diǎn):
結(jié)構(gòu):這種類型的儀器多為單光束型,即只有一束光照射到樣品室內(nèi);光源一般僅有鎢燈;樣品支架一般為推拉式四聯(lián)池架;波長選擇多為手動查找,重復(fù)性差;狹縫為一個固定寬度模式;光學(xué)性能指標(biāo)較低;檢測器多為光敏二極管;顯示器多為機(jī)械表頭或數(shù)碼管顯示器,數(shù)據(jù)處理器一般沒有。此類儀器生產(chǎn)以國內(nèi)廠家居多。
測量模式:多為定點(diǎn)(固定波長)吸光度或透過率測量方式,基本不能進(jìn)行波長掃描測量。
適應(yīng)范圍:小型實(shí)驗(yàn)室及示范教學(xué),分析樣品相對簡單,測試結(jié)果精度要求不高。
?。?)中檔型儀器及其特點(diǎn):
結(jié)構(gòu):此類儀器多為雙光束型或準(zhǔn)雙光束型,但也有單光束儀器型;光源有鎢燈和氘燈;樣品池支架為兩個固定式,分別是樣品通道和參比通道;波長按照設(shè)定模式自動查找或掃描;狹縫多數(shù)仍為2nm固定寬度模式,也有1.5nm狹縫寬度的;檢測器多數(shù)是硅光二極管,但也有少數(shù)用光電倍增管的;光學(xué)性能相對較高,其中光柵的技術(shù)指標(biāo)尤為重要,較佳的光柵為凹面型,為此無論在分辨率還是在雜散光方面指標(biāo)要優(yōu)于簡易型儀器;顯示器為液晶式或連接電腦,數(shù)據(jù)處理可由儀器自身具有的或外接計(jì)算機(jī)處理。并有一定的測量附件。
測量模式:透過率、吸光度、濃度直讀、單光束;單點(diǎn)及掃描均可。
適應(yīng)范圍:此類儀器基本可滿足大多實(shí)驗(yàn)室分析需要。
?。?)高檔型儀器及特點(diǎn):
除了中檔儀器的特點(diǎn)外,主要是光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和制造工藝水平更高了,比如使用了大尺寸的凹面光柵,并且光柵刻槽數(shù)大于1800條/mm;波長檢測范圍有的儀器在近紅外區(qū)已經(jīng)超過1100nm,可達(dá)到2600nm;狹縫均為連續(xù)可調(diào)型,以適應(yīng)高分辨率的需要,波長掃描速度的檔位也增加了,檢測器均使用高靈敏度的光電倍增管和紅外檢測器;數(shù)據(jù)處理目前基本是電腦來執(zhí)行;衡量一臺儀器的另外一個指標(biāo)是看此儀器是否具有豐富的附屬測量器件,如偏振附件、積分球附件、反射附件、自動進(jìn)樣器附件、色度分析軟件、薄膜附件等等。
測量模式:透過率、吸光度、濃度直讀、反射方式、能量方式,單點(diǎn)、掃描均可;
適應(yīng)范圍:科研、光學(xué)產(chǎn)品的檢測、生化樣品檢測、復(fù)雜樣品檢測等。不但可以測液態(tài)樣品,也可測固態(tài)樣品。
分光光度計(jì)就是利用分光光度法對物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器。由于核酸,蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量樣本量很小,于是超微量分光光度計(jì)應(yīng)運(yùn)而生。超微量分光光度計(jì)近年來已經(jīng)替換普通的分光光度計(jì)成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的新寵,廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)等領(lǐng)域。
超微量分光光度計(jì)與傳統(tǒng)分光光度計(jì)相比,前者具備的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)在于:
(1)所需樣品體積小,僅需0.5—2μl;
(2)不需要比色皿,用移液槍直接將樣品滴加到檢測平臺上,測量時樣品自動形成液柱,檢測完成后只需用干凈的吸水紙將樣品從檢測平臺上擦拭干凈即可,避免了因?yàn)楸壬笄逑床粌魩淼慕徊嫖廴荆?/p>
(3)一般具有多個光程(電機(jī)控制自動選擇)【BIO-DLMicroDrop基座模式下光程1.0mm、0.2mm、0.1mm和0.05mm自動調(diào)整】,而傳統(tǒng)分光光度計(jì)的光程為10mm,超微量分光光度計(jì)樣品無需稀釋,測量范圍可達(dá)到常規(guī)分光光度計(jì)的50倍【BIO-DLMicroDrop基座模式下dsDNA檢測范圍:2~15000ng/μl】;
(4)氙氣閃光燈為燈源,代替了氘燈(紫外)和鎢燈(可見),使用壽命更長;
(5)不需要預(yù)熱,可隨時檢測,檢測時間短【BIO-DLMicroDrop<5秒】;
(6)顯示吸光度值的同時,程序直接給出濃度值(核酸、蛋白和熒光染料);
(7)占據(jù)實(shí)驗(yàn)室空間體積比傳統(tǒng)分光光度計(jì)小很多【BIO-DLMicroDrop重量:2.1kg】