可見分光光度計廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、臨床檢測、生物化學(xué)、石油化工、環(huán)保監(jiān)測、食品生產(chǎn)和質(zhì)量控制等部門作定性、定量分析，還可作為大、專院校和中學(xué)相關(guān)課程的教學(xué)演示和實(shí)驗(yàn)儀器。
分光光度計是目前化驗(yàn)室中使用比較廣泛的一種分析儀器，其測定原理是利用物質(zhì)對光的選擇性吸收特性，以較純的單色光作為入射光，測定物質(zhì)對光的吸收，從而確定溶液中物質(zhì)的含量。
其特點(diǎn)是靈敏度高；準(zhǔn)確度高；測量范圍廣；在一定條件下，可同時測定水樣中兩種或兩種以上的物質(zhì)組分含量等。
分光光度計按其波長范圍可分為可見分光光度計(工作范圍360～800nm)、紫外-可見分光光度計(工作范圍200～1000nm)和紅外分光光度計(工作范圍760～400000nm)等。
可見分光光度計的原理是：
當(dāng)一束單色光照射待測物質(zhì)的溶液時，當(dāng)某一定頻率(或波長)的可見光所具有的能量(hf)恰好與待測物質(zhì)分子中的價電子的能級差相適應(yīng)(即ΔE=E2-E1=hf)時，待測物將對該頻率(波長)的可見光產(chǎn)生選擇性的吸收。
用可見分光光度計可以測量和記錄其吸收程度(吸光度)。
由于在一定條件下，吸光度A與待測物質(zhì)的濃度C及吸收地長度l的乘積成正比，即A=KCL，所以，在測得吸光度A后，可采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法、比較法以及標(biāo)準(zhǔn)加入法等方法進(jìn)行定量分析。
可見分光光度計是一種結(jié)構(gòu)簡潔、使用方便的單光束分光光度計，基于樣品對單色光的選擇吸收特性可用于對樣品進(jìn)行定性和定量分析。
其定量分析根據(jù)相對測量原理工作，即選定樣品的溶劑(或空氣)作為標(biāo)準(zhǔn)試樣，設(shè)定其透射比為100%，被測樣品的透射比則相對于標(biāo)準(zhǔn)試樣(或空氣)而得到；
在一定的濃度范圍，各參量遵循朗伯—比耳定律：A=lg1/T=KCL
T=I/I0
A:吸光度
T:相對于標(biāo)準(zhǔn)試樣的透射比
I:光透過被測樣品后照射到光電傳感器上的強(qiáng)度I0:光透過標(biāo)準(zhǔn)試樣后照射到光電傳感器上的強(qiáng)度
K:樣品溶液的比消光系數(shù)
L:樣品溶液在光路中的長度
C:樣品濃度
我們該如何使用紫外可見光光度計進(jìn)行雜光散光測試呢?下面跟我一起來了解一下吧。
據(jù)了解，有的紫外可見光光度計只測試220nm處的雜散光，不測試340nm處的雜散光，這樣是不正確的，需測試220nm處雜散光是因?yàn)椋?/p>
①根據(jù)儀器學(xué)理論中的電光源理論，氘燈在220nm處能量很小，即信號很小，容易顯現(xiàn)雜散光;
②根據(jù)儀器學(xué)理論中的光電發(fā)射理論，光電倍增管在220nm處的光譜響應(yīng)(靈敏度)低，容易顯現(xiàn)雜散光。
③根據(jù)量子光學(xué)理論，波長是能量的倒數(shù)，波長短能量大，容易產(chǎn)生雜散光，而220nm處屬于短波部分;
而測試340nm處雜散光的原因是完全不同的，因?yàn)?40nm處一般是氘燈換鎢燈和儀器調(diào)換濾光片的地方，此時最容易產(chǎn)生雜散光。所以，對于紫外可見光光度計來講，應(yīng)該測試220nm和340nm兩處的雜散光。
紫外可見光光度計雜散光測試步驟：
1、首先將參比液注入配對石英石吸收池，分別放置在參比池座和試樣池座內(nèi)。再測定波段掃描基線并使之平滑。
2、將減光片插入試樣光路的濾光片槽內(nèi)，其讀數(shù)即為減光片的衰減值K，然后將減光片插入?yún)⒈裙饴返臑V光片座內(nèi)，
3、將石英吸收池中的蒸餾水依次換成上述截止濾光液，插入試樣試樣池座中，在相應(yīng)的波段內(nèi)掃描、打印;在記錄紙的作標(biāo)上量取測定波長處的透光度，乘以衰減值K，即得各測定波長處的雜散光值。
紫外可見光光度計儀器設(shè)計的理論依據(jù)是比耳定律。研究的是物質(zhì)對光的吸收。比耳定律的真正物理意義可以描述為：當(dāng)一束平行的單色光通過某一均勻的有色溶液時，溶液的吸光度與溶液的濃度和光程的乘積成正比。它是吸收光度分析中定量分析的最基礎(chǔ)、最根本的依據(jù)，更是紫外可見光光度計的基礎(chǔ)的原理。
熒光分光光度計是用于掃描液相熒光標(biāo)記物所發(fā)出的熒光光譜的一種儀器。其能提供包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強(qiáng)度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振等許多物理參數(shù)，從各個角度反映了分子的成鍵和結(jié)構(gòu)情況。
熒光分光光度計的基本原理：
由高壓汞燈或氙燈發(fā)出的紫外光和藍(lán)紫光經(jīng)濾光片照射到樣品池中，激發(fā)樣品中的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，熒光經(jīng)過濾過和反射后，被光電倍增管所接受，然后以圖或數(shù)字的形式顯示出來。 物質(zhì)熒光的產(chǎn)生是由在通常狀況下處于基態(tài)的物質(zhì)分子 吸收激發(fā)光后變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài), 這些處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的,在返回基態(tài)的過程中將一部分的能量又以光的形式放出，從而產(chǎn)生熒光。
不同物質(zhì)由于分子 結(jié)構(gòu)的不同,其激發(fā)態(tài)能級的分布具有各自不同的特征，這種特征反映在熒光上表現(xiàn)為各種物質(zhì)都有其特征熒光激發(fā)和發(fā)射光譜;，因此可以用熒光激發(fā)和發(fā)射光譜的不同來定性地進(jìn)行物質(zhì)的鑒定。
熒光分光光度計的優(yōu)缺點(diǎn)：
優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，可以用于掃描液相熒光標(biāo)記物所發(fā)出的熒光光譜，不但可以做一般的定量分析, 而且還可以推斷分子在各種環(huán)境下的構(gòu)象變化, 從而闡明分子結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。
缺點(diǎn)：
1、熒光的光強(qiáng)并不高，所以呈線性情況有時不很理想；
2、某些反應(yīng)熒光持續(xù)的時間較短；
3、熒光的發(fā)散方向不集中，不像透射光那樣集中，強(qiáng)度高；
4、受某些離子的干擾影響，熒光會湮滅，試驗(yàn)速度必須要快。
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