分光光度法是指應(yīng)用分光光度計(jì)的分析方法，具有靈敏、準(zhǔn)確、快速及選擇性好等特點(diǎn)。
通常所測(cè)樣品溶液濃度下限可達(dá)10-6~10-5mol/L，適用于測(cè)定食品中的微量組分（如肉制品中的亞硫酸鹽、糖果中的二氧化硫等）。
原理
物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收
當(dāng)光束照射到物質(zhì)上時(shí)，光與物質(zhì)發(fā)生相互作用，產(chǎn)生反射、散射、吸收或透射。
若被照射的是均勻溶液，光的散射可以忽略。
溶液顏色的產(chǎn)生
當(dāng)一束白光通過(guò)某一有色溶液時(shí)，一些波長(zhǎng)的光被溶液吸收，另一些波長(zhǎng)的光則透過(guò)溶液。
透射光或反射光刺激人眼使人感到顏色的存在。
人把自身能感覺(jué)到的光定義為可見(jiàn)光。
在可見(jiàn)光區(qū)，不同波長(zhǎng)的光呈現(xiàn)不同的顏色，因此溶液的顏色由透射光的波長(zhǎng)所決定。
透射光與吸收光可組成白光，故稱(chēng)這兩種光互為補(bǔ)色光，兩種顏色互為補(bǔ)色。
光吸收的本質(zhì)
當(dāng)一束光照射到某物質(zhì)或其溶液時(shí)，組成該物質(zhì)的分子、原子或離子與光子發(fā)生“碰撞”;
光子的能量就轉(zhuǎn)移到分子、原子或離子上，是這些粒子由最低能態(tài)（基態(tài)）躍遷到較高能太（激發(fā)態(tài)），這個(gè)作用稱(chēng)為物質(zhì)對(duì)光的吸收。
被激發(fā)的粒子約在10-8s后回到基態(tài)，并以熱或熒光等形式釋放出能量。
分子、原子或離子具有不連續(xù)的量子化能級(jí)，僅當(dāng)照射光光子的能量hυ，與被照射物質(zhì)粒子的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量之差相當(dāng)時(shí)，才能發(fā)生吸收。
不同物質(zhì)微粒由于結(jié)構(gòu)不同而具有不同的量子化能級(jí)，其基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量差也不相同。
所以物質(zhì)對(duì)光的吸收具有選擇性。
吸收曲線
吸收曲線，也稱(chēng)為吸收光譜，描述了物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光的吸收能力。
將不同波長(zhǎng)的光透過(guò)某一固定濃度和厚度的有色溶液，測(cè)量每一波長(zhǎng)下有色溶液對(duì)光的吸收程度（即吸光度）；
然后以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)作圖，繪制的曲線即為吸收曲線。
不同濃度的同一物質(zhì)，在吸收峰附近的吸光度隨著濃度增加而增大，但最大吸收波長(zhǎng)不變。
若在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，則靈敏度最高。
因此，吸收曲線是分光光度法中選擇測(cè)定波長(zhǎng)的重要依據(jù)。
光吸收基本定律
即朗伯-比爾定律：
當(dāng)一束平行單色光通過(guò)液層厚度為b的有色溶液時(shí)，溶質(zhì)吸收了光能，光的強(qiáng)度就要減弱。
溶液的濃度越大，通過(guò)的液層厚度越大，入射光越強(qiáng)，則光被吸收的越多，光強(qiáng)度的減弱也越顯著。
該定律是紫外可見(jiàn)分光光度法等各類(lèi)吸光光度法定量分析的依據(jù)，是由實(shí)驗(yàn)觀察得到的，不僅適用于溶液，也適用于其他均勻非散射的吸光物質(zhì)。
A=lg(I/I0)=εbc
A-吸光度；
I0-入射光強(qiáng)度，cd；
I-透射光強(qiáng)度，cd；
ε-吸光系數(shù)，L/(mol˙cm)；
b-液層厚度（光程長(zhǎng)度），cm；
c-有色溶液的濃度，mol/L。
其物理意義為：
當(dāng)一束平行單色光通過(guò)單一均勻、非散射的吸光物質(zhì)溶液時(shí)，溶液的吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。
式中ε是吸光物質(zhì)在特定波長(zhǎng)和溶劑的情況下的一個(gè)特征常數(shù)，數(shù)值上等于濃度為1mol/L的吸光物質(zhì)在1cm光程中的吸光度。
ε是吸光物質(zhì)吸光能力的量度，ε值越大，方法的靈敏度越高。
由實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算ε時(shí)，常以被測(cè)物質(zhì)的總濃度代替吸光物質(zhì)的濃度，實(shí)際上時(shí)表觀摩爾吸光系數(shù)。
在多組分體系中，如果各種吸光物質(zhì)之間沒(méi)有相互作用，體系的總吸光度等于各組分吸光度之和，即吸光度具有加和性。
透光度T是透射光強(qiáng)度I與入射光強(qiáng)度I0之比，即：
T=I/I0
因此：A=lg(1/T)
紫外分光光度計(jì)是實(shí)驗(yàn)室普及率很高的一種光譜儀器，由于靈敏度高、選擇性好、準(zhǔn)確度高、適用濃度范圍廣，而且分析成本低、操作簡(jiǎn)便、快速得到廣泛的應(yīng)用，長(zhǎng)期在分析領(lǐng)域扮演很重要的角色。
在選擇這類(lèi)儀器時(shí)要考慮哪些因素呢？
1、光學(xué)構(gòu)造（OPTICALCONFIGURATION）
一般來(lái)說(shuō)，紫外光分光光度計(jì)分為單光束和雙光束兩類(lèi)。顧名思義，單光束型主要是依賴(lài)單束光進(jìn)行測(cè)量。一束給定波長(zhǎng)的光通過(guò)對(duì)照物，然后再通過(guò)實(shí)際樣品溶液，就能得到吸光結(jié)果。
雙光束型則是通過(guò)一個(gè)斬光輪（mirroredchopperwheel）將一束光分成兩束，分別測(cè)量對(duì)照樣品和實(shí)際樣品。
可以最小化光漂移（lampdrift）和減少測(cè)量時(shí)間。一些雙光型光度計(jì)不利用斬光輪，而是利用一種光束分光器來(lái)代替，將一束光分成兩束平行的光然后同時(shí)測(cè)量對(duì)照樣品和目的樣品。
因?yàn)樵黾恿藴y(cè)量的速度，所以雙光束分光光度計(jì)在測(cè)量一些溶液隨時(shí)間動(dòng)態(tài)變化的研究中大有用處。
2、光源和檢測(cè)方法（LIGHTSOURCESANDDETECTION）
分光光度計(jì)的光譜也是需要考慮的一個(gè)重要因素。實(shí)驗(yàn)室研究人員希望省錢(qián)購(gòu)入專(zhuān)門(mén)儀器定量核酸、蛋白或者細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。
例如AmershamBiosciencesofPiscataway公司的GeneQuantII能在230、260、280、320、595和600nm的波長(zhǎng)下測(cè)量樣品。果果需要更大的靈活性，研究者可以考慮一種更高性能的寬光譜儀器，可以程序性地進(jìn)行ELISAs分析和比色分析。
紫外分光光度計(jì)一般覆蓋190nm和380nm波長(zhǎng)，通常利用氘燈照明。一些特殊的儀器可以提供滿足光子學(xué)和半導(dǎo)體研究需要的光譜范圍。
VarianofPaloAlto公司的CaryDeepUV和HitachiHighTechnologiesofTokyo的U-7000AutomatedVacuumUVSystem就是這樣的儀器。
一些儀器具有多種光源供選擇：
紫外光、可見(jiàn)光和甚至紅外光（780nm至3,000nm）。鎢燈和鹵素?zé)粢话阒桓采w可見(jiàn)光部分（大約380nm到800nm）。而氙燈則可以覆蓋紫外光和可見(jiàn)光區(qū)域。
分光光度計(jì)的帶寬（bandwidth）很大程度上依賴(lài)于單色儀的狹縫的寬度。可以投射出實(shí)驗(yàn)精確要求的光譜。
一種嚴(yán)格帶寬使得儀器能對(duì)復(fù)雜的混合物進(jìn)行高分辨率的吸光測(cè)量?？勺兊膯紊珒x的狹縫寬度能使一臺(tái)分光光度計(jì)滿足多種實(shí)驗(yàn)需要。
為了測(cè)量吸光值，分光光度計(jì)制造商通常使用光電倍增管（photo-multipliertubes，PMTs）和光敏二極管。
PMTs提供快速的反應(yīng)時(shí)間和良好的靈敏度，并且可以在紫外光譜調(diào)節(jié)至特定的范圍。但一些制造商依賴(lài)于光敏二極管的動(dòng)態(tài)范圍在數(shù)秒內(nèi)行使所有的光譜測(cè)量。
3、樣品類(lèi)型（SAMPLEFORMAT）
在大部分的樣品類(lèi)型中，分光光度計(jì)可接受樣品孔、小玻璃管cuvette、吸漿管和微孔板。微孔板主要是滿足高通量的需要和大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室需求。
但盡管對(duì)于小實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，制造商仍然提供了多種容器轉(zhuǎn)換器來(lái)滿足通量的要求和減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
用小試管cuvette裝樣品容量一般從1μl-5ml，并且一些儀器裝備了各種樣品固定物來(lái)滿足各種改變需要。體現(xiàn)了柔韌性。
4、數(shù)據(jù)管理（DATAMANAGEMENT）
大部分單機(jī)型的分光光度計(jì)包含了驅(qū)動(dòng)儀器運(yùn)行和管理數(shù)據(jù)的軟件。高性能的儀器，通常與PC機(jī)一起聯(lián)用，需要從制造商提供額外的軟件。同時(shí)用戶也可以選擇升級(jí)軟件以滿足他們的需要。
另外一個(gè)值得考慮的因素是數(shù)據(jù)的最終使用。各獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室都有各自感興趣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
例如一些藥物機(jī)構(gòu)需要考慮美國(guó)FDA的要求和歐聯(lián)盟的藥物評(píng)價(jià)機(jī)構(gòu)的要求選擇不同的數(shù)據(jù)處理方式。
分光光度計(jì)所采用的分光光度法在定量分析領(lǐng)域中的應(yīng)用已有數(shù)十年的歷史,至今仍是實(shí)驗(yàn)室中常用的分析方法之一。隨著現(xiàn)代科學(xué)儀器的不斷發(fā)展,在傳統(tǒng)的追求準(zhǔn)確、快速、可靠的同時(shí),小型化、智能化、在線化、網(wǎng)絡(luò)化成為了現(xiàn)代可見(jiàn)分光光度計(jì)新的增長(zhǎng)點(diǎn)。
結(jié)構(gòu)組成
分光光度計(jì)的基本組成和大多數(shù)分光光度計(jì)一樣,都是由光源、單色器、比色池、光電檢測(cè)器和放大器幾部分組成。
1.光源
分光光度計(jì)的可見(jiàn)區(qū)的光源仍是采用鹵素鎢燈和氘燈。鹵素鎢燈的工作波長(zhǎng)范圍為:320～2500nm,氘燈的工作波長(zhǎng)范圍為180～375nm。兩光源有儀器上的一個(gè)燈選擇反射鏡自動(dòng)進(jìn)行選擇和光源切換。
1.2單色器(分光系統(tǒng))
單色器是分光光度計(jì)的重要部分,比濾光片選擇波長(zhǎng)能更有效地提供帶寬窄的單色光。是采用先進(jìn)的光柵單色器,由入射狹縫、出口狹縫、色散元件、準(zhǔn)直鏡等光學(xué)元件組成。入射狹縫是用來(lái)調(diào)節(jié)入射單色光的純度和強(qiáng)度，也直接影響分辨率。而準(zhǔn)直鏡(反射凹面鏡)的作用一是將入射光束變?yōu)槠叫泄馐笤龠M(jìn)入色散元件，二是把來(lái)自色散元件的平行光束聚焦于出口狹縫上,形成光譜像。出口狹縫是單色光的出口，它只讓光譜帶中所需要波長(zhǎng)的光從狹縫中透出，而將其他波長(zhǎng)的光擋住,不讓其通過(guò)。
色散元件是單色器中的核心元件，起著將復(fù)合光分解為單色光的作用。分光光度計(jì)的色散元件是凹面反射式全息光柵,它本身就起著分解復(fù)合光和準(zhǔn)直鏡(聚焦)的作用,而且全息光柵具有雜散光小、不產(chǎn)生偽線和分辨率高的優(yōu)點(diǎn)。
1.3比色池
分光光度計(jì)配有多種規(guī)格樣品池架和比色杯。池架有標(biāo)準(zhǔn)池架、七位池架、50霯微量池架和多形態(tài)樣品池架。比色杯有常量(2～4mL)、半微量(0.5～1mL)和微量(50～100霯),使用方便。另外還配有樣品架卡套,分為特為酶動(dòng)力學(xué)設(shè)計(jì)的半導(dǎo)體溫控池:溫度范圍15～50℃,和流動(dòng)池。
正確使用分光光度計(jì)
分光光度計(jì)操作簡(jiǎn)便。
打開(kāi)儀器電源開(kāi)關(guān)，儀器應(yīng)順利通過(guò)自檢，然后預(yù)熱10分鐘左右，可以進(jìn)行測(cè)定。讀數(shù)時(shí)應(yīng)記錄最先顯示的數(shù)值，不要讓樣品連續(xù)光照時(shí)間太長(zhǎng)(動(dòng)力學(xué)測(cè)定除外)，特別是在紫外區(qū)域測(cè)定時(shí)更要快速，因?yàn)殡S著光的連續(xù)照射讀數(shù)會(huì)下降，變得不穩(wěn)定。而應(yīng)用顯色劑顯色后會(huì)使讀數(shù)穩(wěn)定，給測(cè)定帶來(lái)方便，同時(shí)還會(huì)使物質(zhì)中許多元素的摩爾吸光系數(shù)由原來(lái)的幾萬(wàn)提高到數(shù)十萬(wàn)，明顯提高了檢測(cè)靈敏度。
作為一種分子吸收光譜儀,廣泛應(yīng)用于化學(xué)研究、生物醫(yī)藥、環(huán)境科學(xué)和食品分析等研究領(lǐng)域。它具有分析精度高、應(yīng)用范圍廣、分析簡(jiǎn)便快速和儀器靈敏度較高的優(yōu)點(diǎn),是目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室常用的定量分析儀器。
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