液相色譜儀系統(tǒng)由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。
儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進樣器進入流動相；
被流動相載入色譜柱（固定相）內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)；
在兩相中作相對運動時，經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別；
被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀；
數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來高效液相色譜儀主要有進樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；
下面將分別敘述其各自的組成與特點。
進樣系統(tǒng)
一般采用隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作，進樣量是恒定的。
這對提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。
輸液系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。
高壓泵的一般壓強為47～44X10Pa，流速可調(diào)且穩(wěn)定，當高壓流動相通過層析柱時；
可降低樣品在柱中的擴散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動速度；
這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。
流動相貯存器和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變；
包括改變洗脫液的極性、離子強度、PH值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。
這就可使各種物質(zhì)（即使僅有一個基團的差別或是同分異構(gòu)體）都能獲得有效分離。
分離系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。
色譜柱一般長度為10～50cm（需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管）；
內(nèi)徑為2～5mm，由"優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成；
住內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質(zhì)和固定液構(gòu)成）。
固定相中的基質(zhì)是由機械強度高的樹脂或硅膠構(gòu)成；
它們都有惰性（如硅膠表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔徑可達1000?）和比表面積大的特點；
加之其表面經(jīng)過機械涂漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣）；
或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因（如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體的有機化合物。
因此，這類固定相對結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性。
例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。
另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴散效應(yīng)。
基質(zhì)粒度小，微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。
根據(jù)柱效理論分析，基質(zhì)粒度小，塔板理論數(shù)N就越大。
這也進一步證明基質(zhì)粒度小，會提高分辨率的道理。
再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60C；
通過改善傳質(zhì)速度，縮短分析時間，就可增加層析柱的效率。
液相色譜儀在高效使用中需注意以下幾個問題：
1、色譜柱中的流動相是否會會排干的問題：
不少做色譜分離試驗的人遇到過這樣的情形：不慎未及時補充流動相，泵將溶劑瓶中的流動相吸干了，HPLC系統(tǒng)由此而停止工作了。如此情況是否會損壞色譜柱?泵是否已將色譜柱中所有流動相都排干了?色譜柱還能使用嗎?事實上，如果泵將溶劑瓶中的流動相吸干，并不會造成色譜柱的損壞。即使泵中充滿了空氣，泵也不會將空氣排入色譜柱。因為泵只能輸送液體，而不能輸送空氣。
2、色譜柱變干的問題：
另一個更可能發(fā)生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太松而使色譜柱變干。同樣，整個色譜柱干涸的情況不太容易發(fā)生，多半可能只是色譜柱兩端的幾個毫米變干了，因揮發(fā)掉所有溶劑是色譜柱變干需要相當長的時間。即使色譜柱真的變干了，也不一定就不可救藥了。可以嘗試用一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑(如經(jīng)氦氣脫氣的甲醇)沖洗色譜柱以除去氣體。較低的表面張力有助于浸潤填料表面;已脫氣的溶劑應(yīng)該能夠溶解并去除滯留在填料中的氣體。色譜柱大約需要(以1mL/min的流速)沖一個小時或更多的時間被徹底浸潤，恢復(fù)到正常狀態(tài)。
3、使用PEEK(polyetheretherketone)管路和接頭需要注意以下問題：
如果經(jīng)常需要改變流路或更換不同品牌的色譜柱，使用PEEK材料制成的管路和接頭會非常方便。PEEK管路容易連接;PEEK接頭不僅無需工具，手擰即可固定，而且容易調(diào)節(jié)錐箍之外的管路長度，方便與不同品牌或規(guī)格的色譜柱相連接。
使用此類材料的管路需要注意的是：PEEK對鹵代烷烴和四氫呋喃的兼容性不好。雖然未觀察到上述溶劑溶解PEEK材料的明顯跡象，但PEEK遇到上述溶劑會變脆。另一個西藥考慮的因素是壓力限。不銹鋼管可耐受6000psi的壓力，但PEEK管只能耐受近4000psi(但多數(shù)HPLC應(yīng)用系統(tǒng)壓力不會超過3000psi)。
使用PEEK接頭時則無需擔心接頭耐溶劑性能，因為接頭幾乎或很少與溶劑直接接觸。但手擰固定的PEEK接頭壓力限低于不銹鋼管，因而壓力太高時，可能會使接頭在管路上滑動而產(chǎn)生死體積或漏液。
4、預(yù)防液相泵的故障：
處于良好操作狀態(tài)的泵，應(yīng)該能使色譜圖上的基線平穩(wěn);保留時間的重復(fù)性好。在等度洗脫時壓力波動小于2%。梯度洗脫時壓力變化應(yīng)是緩慢和平穩(wěn)的。 要保持泵的良好操作性能,必須維護系統(tǒng)的清潔,保證溶劑和試劑的質(zhì)量,對流動相進行過濾和脫氣.下面列出預(yù)防泵故障的幾項措施：
1)用高質(zhì)量試劑和HPLC級溶劑;
2)過濾流動相和溶劑;
3)脫氣;
4)每天開始使用時放空排氣，工作結(jié)束后從泵中洗去緩沖液;
5)不讓水或腐蝕性溶劑滯留泵中;
6)定期更換墊圈;
7)需要時加潤滑油;
8)查閱有關(guān)泵操作手冊中的其它建議。
9)為了使故障發(fā)生后盡快排除，平時應(yīng)常備密封、單向閥(入口與出口)、泵頭裝置、各式接頭、保險絲等部件，以及更換工具。
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