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液相色譜儀流動相的選擇與優(yōu)化 液相色譜操作規(guī)程

時間:2020-05-16    來源:儀多多儀器網(wǎng)    作者:儀多多商城     
  【中國儀器網(wǎng) 使用手冊】液相色譜是目前應用多的色譜分析方法,液相色譜系統(tǒng)由流動相儲液體瓶、輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成,其整體組成類似于氣相色譜,但是針對其流動相為液體的特點作出很多調(diào)整。液相色譜的流動相通常是各種低沸點溶劑和水溶液。它是影響分離的一個非常重要因素。在實際工作中,流動相的選擇和優(yōu)化是確定色譜分析的主要工作。
 
  選擇方法
 
  1、由強到弱:一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進行試驗,這樣可以很快地得到分離結(jié)果,然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機溶劑(乙腈或甲醇)的比例。
 
  2、三倍規(guī)則 :每減少10%的有機溶劑(甲醇或乙腈)的量,保留因子約增加3倍,此為三倍規(guī)則。這是一個聰明而又省力的辦法。調(diào)整的過程中,注意觀察各個峰的分離情況。
 
  3、粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào):當分離達到一定程度,應將有機溶劑10%的改變量調(diào)整為5%,并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率,直至各組分的分離情況不再改變。
 
  脫氣方法
 
  1、吹氦脫氣法
 
  利用氦氣在液體中溶解度比空氣低的特性,在0.1MPa壓力下,以約60mL/min流速通入流動相儲液容器中10~15min,可以很有效地從流動相中排除溶解的空氣,能排除接近80%的氧氣。采用一個分布式噴射流裝置,一體積的氦氣可從流動相中將等體積的幾乎全部氣體排除。這意味著1L氦氣通過1L流動相就可完成排氣這個工作。這種脫氣方法雖然好,但氦氣價格較高,很少使用。
 
  2、加熱回流法
 
  此法的脫氣效果較好。在操作時要注意冷凝塔的冷卻效率,否則溶劑會丟失,混合流動相的比例會有變化。
 
  3、抽真空脫氣法
 
  此法可使用真空泵,降壓至0.05~0.07MPa,即可除去溶解的氣體。但是由于真空脫氣會使混合溶劑組成發(fā)生變化,從而影響到實驗的重現(xiàn)性,因此多用于單溶劑體系的簡單分析。
 
  4、超聲波脫氣法
 
  將欲脫氣的流動相置于超聲波清洗器中,用超聲波震蕩10~20min。此法的脫氣效果差。
 
  5、在線脫氣法
 
  HPLC儀器均可配置專門的在線脫氣機。在線脫氣使用簡單,低故障,有效。
 
  注意事項
 
  1、流動相溶劑應選擇HPLC的溶劑或依此為標準的溶劑。流動相使用前用0.45μm濾膜過濾、脫氣,清除微粒和灰塵。 在送液泵內(nèi),為了防止雜物(固體)進入流路,裝有吸濾器,但網(wǎng)孔徑為10μm,比此更小的顆粒仍然可通過,這會導致流路和柱子堵塞和污染。為此,建議常用0.45μm濾膜過濾。流動相溶劑須經(jīng)脫氣,如不脫氣,在溶劑混合時,或壓力溫度變化時容易產(chǎn)生大量氣泡,會導致泵誤動作和輸液不暢,檢測器產(chǎn)生噪聲信號等。
 
  2、流動相恢復到室溫后使用。流動相溫度與室溫相差時,流動相在恢復到室溫前,基線水平很難穩(wěn)定,特別是發(fā)生漂移,也容易產(chǎn)生氣泡等現(xiàn)象。水與有機溶劑混合時,混合液變化大,往往會與室溫相差很大,務必注意。
 
  3、做HPLC流動相的試劑應用HPLC級的、水應用二次蒸餾水,水相流動相需經(jīng)常更換,防止長菌變質(zhì)。使用去離子水、針劑水、純凈水(炊用)并不合適、尤其是做梯度洗脫時,水中的不純物會成為鬼峰,從而干擾分析結(jié)果。
 
  4、流動相的pH值過高或過低,流動相使用純水,使用高濃度磷酸鹽緩沖溶液,使用離子對試劑等,均可能造成色譜柱填料被化學破壞,這種對色譜柱固定相及鍵合相的破壞通常是不可修復的
 
  5、用緩沖鹽做流動相時,在使用前和使用后都要用水清洗流路,禁止將緩沖溶液留在流路中靜置過夜或更長時間。
 
  6、若需要使用含鹽的流動相,使用前請務必過濾。并且使用該含鹽流動相前,色譜柱需先用低比例有機相(有機相含量應不低于10%)的溶液沖洗,以免緩沖鹽析出。流動相若為蒸餾水或含鹽的緩沖液,建議現(xiàn)用現(xiàn)配,以免流動相因滋生微生物而造成柱填料的污染。
 
  7、進行梯度實驗時要注意梯度變化過程中流動相的互溶性,避免因流動相不互溶而導致的緩沖鹽析出問題。反相系統(tǒng)更換正相系統(tǒng)或正相系統(tǒng)更換反相系統(tǒng)時,用異丙醇置換系統(tǒng)內(nèi)的儲存流動相后在接柱子。
 
  8、在更換兩種互不相溶的流動相時,中間要用異丙醇溶液清洗過渡。例如:先用甲醇水做流動相,然后在用正己烷做流動相時,一定要先用異丙醇溶液沖洗甲醇水,然后用正己烷沖洗異丙醇,反之也是一樣。在更換流動相時還要考慮色譜柱是否更換。
 
  9、儀器在短期(兩三天)不用時,流路中可以是甲醇或水。儀器在長期不用時,流路中應用甲醇。
 
  10、對于UV等檢測器用于高靈敏度檢測時,要使用UV吸收性小的HPLC的溶劑作為流動相溶劑,如甲醇、乙腈等。
 
  11、當流動相溶劑為乙腈時,流速為1ml/min泵的正常壓力5~7Mpa之間,如果壓力逐漸降低,基線也出現(xiàn)異常。這是由于乙氰的粘性大,導致泵的流速降低??蛇m當提高流速使泵的壓力恢復正常即可。
 
  12、流動相含有濃硫酸、濃硝酸、二氯乙酸、二氯甲烷、氯仿、丙酮、四氯呋南、二甲化砜等溶劑,會對流路中的PEEK樹脂管路強度變成差、PEEK樹脂管容易破裂使溶劑外濺。流動相含有鹵素離子的溶劑,如KCI、NaCI、NH4CI等。對流路中的不銹鋼材料有腐蝕作用,以上的溶劑須盡量避免使用。非用不可時,分析完了后,應立刻用蒸餾水把全流路清洗干凈。
 
  13、用于檢定梯度等性能時,短時間使用在0.5%以下的低濃度丙酮水溶液是沒有問題的。
 
  14、注意:稀硝酸與甲醇不能混合,否則有可能會引起爆炸。

高效液相色譜的幾大特點

  高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎上,引用了氣相色譜的理論,在技術上,流動相改為高壓輸送(最高輸送壓力可達4、9~107Pa);色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成,從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜(每米塔板數(shù)可達幾萬或幾十萬);同時柱后連有高靈敏度的檢測器,可對流出物進行連續(xù)檢測。

  特點

  1、高壓:液相色譜法以液體為流動相(稱為載液),液體流經(jīng)色譜柱,受到阻力較大,為了迅速地通過色譜柱,必須對載液施加高壓。一般可達150~350×105Pa。

  2、高速:流動相在柱內(nèi)的流速較經(jīng)典色譜快得多,一般可達1~10ml/min。高效液相色譜法所需的分析時間較之經(jīng)典液相色譜法少得多,一般少于1h。

  3、高效:近來研究出許多新型固定相,使分離效率大大提高。

  4、高靈敏度:高效液相色譜已廣泛采用高靈敏度的檢測器,進一步提高了分析的靈敏度。如熒光檢測器靈敏度可達10-11g。另外,用樣量小,一般幾個微升。

  5、適應范圍寬:氣相色譜法與高效液相色譜法的比較:氣相色譜法雖具有分離能力好,靈敏度高,分析速度快,操作方便等優(yōu)點,但是受技術條件的限制,沸點太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應用氣相色譜法進行分析。而高效液相色譜法,只要求試樣能制成溶液,而不需要氣化,因此不受試樣揮發(fā)性的限制。對于高沸點、熱穩(wěn)定性差、相對分子量大(大于400以上)的有機物(這些物質(zhì)幾乎占有機物總數(shù)的75%~80%)原則上都可應用高效液相色譜法來進行分離、分析。據(jù)統(tǒng)計,在已知化合物中,能用氣相色譜分析的約占20%,而能用液相色譜分析的約占70~80%。

標簽: 液相色譜儀
液相色譜儀 高效液相色譜的幾大特點_液相色譜儀

通用液相色譜儀的應用

    高效液相色譜法(HPLC)是目前應用廣泛的分析、純化、分離有機化合物的有效方法之一。

    當今社會中約有80%的已知有機化合物能用高效液相色譜法分離、分析,而且由于此法條件溫和,不破壞樣品,因此特別適合熱穩(wěn)定性差、氣化揮發(fā)困難、沸點高的有機化合物和生命物質(zhì)。

 

    液相色譜儀經(jīng)常應用于環(huán)境分析、食品分析、生命科學、分子生物學、臨床藥品檢測分析等領域。

    液相色譜儀由溫度控制系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、高壓輸液泵等組成,是利用被檢測物在兩種液體之間分配比的差異,對被檢測物進行先分離,而后分析鑒定的儀器。

    儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進樣器進入流動相,被流動相載入色譜柱內(nèi),由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù),在兩相中作相對運動時,經(jīng)過反復多次的吸附-解吸的分配過程,各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別,被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出,通過檢測器時,樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀,數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。

    通用儀器作為國內(nèi)液相色譜儀的優(yōu)秀品牌一直堅持研發(fā)生產(chǎn)出更好更準確的液相色譜儀。他的液相色譜儀產(chǎn)品都擁有自己的技術以及產(chǎn)權。

    具有:壓力實時檢測顯示,高壓限、低壓限報警,隨系統(tǒng)壓力變化流速自動補償?shù)墓δ埽灰约按_保檢測器低噪聲、低漂移、超高靈敏度、提高了圖譜的分辨能力和準確率的能力。

標簽: 液相色譜儀
液相色譜儀 通用液相色譜儀的應用_液相色譜儀

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