流動相脫氣是液相色譜儀提高檢測性能和保護色譜柱的有效措施。
一、液相色譜儀液相色譜儀流動相脫氣的目的：
1、使色譜泵輸液均勻準(zhǔn)確，減小脈動。
2、提高保留時間和色譜峰面積的重現(xiàn)性。
3、防止氣泡引起尖峰。
4、使基線穩(wěn)定，提高信噪比。
5、降低溶劑的紫外吸收本底。
6、減少死體積。
7、防止填料氧化。
二、液相色譜儀流動相常用的脫氣方法：
1、吹氦脫氣法：
利用液體中氦氣的溶解度比空氣低的特性，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，適合所有溶劑。但成本高，使用較少。
2、加熱回留法：
脫氣效果比較好，但操作復(fù)雜。
3、超聲波脫氣法：
操作簡單，但脫氣效果不理想。
4、抽真空脫氣法：
利用真空泵降壓至0.05～0.07MPa，可除去溶劑中的氣體。但抽真空會引起混合溶劑組分的變化，從而影響實驗的重現(xiàn)性，多用于單一溶劑體系。
5、在線真空脫氣法：
利用膜滲透技術(shù)，在線真空脫氣，智能控制，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。
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1、液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么？ ?、俸Y板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子?！ 、诖嬖诟蓴_峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動相或更換選擇性好的柱子 ?、劭赡苤d，減少進樣量?！ ?、HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法是什么？ ?、贅悠妨坎蛔悖鉀Q辦法為增加樣品量 ?、跇悠肺磸闹又辛鞒??？筛鶕?jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動相或柱子 ?、蹣悠放c檢測器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢測器 ?、軝z測器衰減太多。調(diào)整衰減即可?！ 、輽z測器時間常數(shù)太大。解決辦法為降低時間參數(shù) ?、迿z測器池窗污染。解決辦法為清洗池窗。 ?、邫z測池中有氣泡。解決辦法為排氣?！ 、?font color="#0268CA">記錄儀測壓范圍不當(dāng)。調(diào)整電壓范圍即可?！ 、崃鲃酉嗔髁坎缓线m。調(diào)整流速即可?！ 、鈾z測器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線?！ ?、做HPLC分析時，柱壓不穩(wěn)定，原因何在？如何解決？ ?、俦脙?nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對溶劑進行脫氣處理； ②比例閥失效，更換比例閥即可； ③泵密封墊損壞，更換密封墊即可； ?、苋軇┲械臍馀?，解決的辦法是對溶劑脫氣，必要時改變脫氣方法； ?、菹到y(tǒng)檢漏，找出漏點，密封即可； ?、尢荻认疵摚@時壓力波動是正常的。 4、我購買的HPLC柱驗收測試時柱壓過高，請問為什么？ 柱壓過高是HPLC柱用戶經(jīng)常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因?！ 、俨鹑ケＷo預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護柱的問題，若柱壓仍高，再檢查； ?、诎?font color="#0268CA">色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查； ?、蹖⒅拥倪M出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動相沖洗柱子，（此時不要連接檢測器，以防固體顆粒進入流動池）。這時，如果柱壓仍不下降，再檢查；只用于使用過的柱子。 ?、芨鼡Q柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商聯(lián)系。一般情況下，在進樣器與保護柱之間接一個在線過濾器便可避免柱壓過高的問題。 5、色譜柱中的流動相會排干嗎？ 不少做色譜分離試驗的人遇到過這樣的情形：不慎未及時補充流動相，泵將溶劑瓶中的流動相吸干了，HPLC系統(tǒng)由此而停止工作了。如此情況是否會損壞色譜柱？泵是否已將色譜柱中所有流動相都排干了？色譜柱還能使用嗎？事實上，如果泵將溶劑瓶中的流動相吸干，并不會造成色譜柱的損壞。即使泵中充滿了空氣，泵也不會將空氣排入色譜柱。因為泵只能輸送液體，而不能輸送空氣。 相比之下，另一個更可能發(fā)生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太松而使色譜柱變干。同樣，整個色譜柱干涸的情況不太容易發(fā)生，多半可能只是色譜柱兩端的幾個毫米變干了，因揮發(fā)掉所有溶劑是色譜柱變干需要相當(dāng)長的時間。即使色譜柱真的變干了，也不一定就不可救藥了?？梢試L試用一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑（如經(jīng)氦氣脫氣的甲醇）沖洗色譜柱以除去氣體。較低的表面張力有助于浸潤填料表面；已脫氣的溶劑應(yīng)該能夠溶解并去除滯留在填料中的氣體。色譜柱大約需要（以1mL/min的流速）沖一個小時或更多的時間被徹底浸潤，恢復(fù)到正常狀態(tài)?！ ?、為何出現(xiàn)峰展寬？ ?、贅悠敷w積過大--用流動相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15% ?、谠谶M樣閥中造成峰擴展--進樣前后排出氣泡以降低擴散 ③數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢--設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點 ?、軝z測器時間常數(shù)過大--設(shè)定時間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的10% ⑤流動相粘度過高--增加柱溫,采用低粘度流動相 ?、迿z測池體積過大--用小體積池,卸下熱交換器 ⑦保留時間過長--等度洗脫時增加強溶劑含量,也可用梯度洗脫 ?、嘀怏w積過大--將連接管徑和連接管長度降至最小 ?、針悠愤^載--進小濃度小體積樣品 7、除了在線脫氣，常用的實驗室脫氣方式還有哪些？ 加熱回流脫氣，脫氣效果較佳，但無法保持；氦脫氣，此方法脫氣效果佳，能除去百分之九十以上的空氣，但氦氣價格太貴，所以用的不多；真空脫氣，效果僅次于氦脫氣，但脫氣過程中容易造成樣品溶液揮發(fā)損失；超聲脫氣，只能脫去約百分之三十的空氣，但在實驗室中常用。目前還是盡量爭取用在線脫氣，方便且效果好?！ ?、如何簡單判斷比例閥是否內(nèi)漏？ 設(shè)定泵使用一個單獨通路（A），打開Purge閥，流速5ml/min，提起其他溶劑瓶內(nèi)的溶劑過濾頭直至離開液面，觀察這些通路（B、C、D）內(nèi)的溶劑是否隨著流動，正常時均不應(yīng)流動。
任何顆粒物進進高效液相色譜儀后都會在柱子進口端被篩板擋住，最后的結(jié)果是將柱子堵塞，表現(xiàn)出的特征是系統(tǒng)壓力增加并使色譜峰變形。因此，要采取各種預(yù)防措施，包括操縱步驟和商品儀器自身的各種過濾設(shè)計，努力防止或減少顆粒物進進高效液相色譜儀中，從而延長儀器和色譜柱的使用壽命，并進步數(shù)據(jù)的可靠性。在高效液相色譜儀中，顆粒物的主要來源有三個途徑：活動相、被測樣品和儀器系統(tǒng)部件的磨損物。
1、被測樣品 液相系統(tǒng)中的第二個顆粒物來源是被測樣品。一些實驗室在將他們的樣品放置在自動進樣器盤（或手動進樣）以前，所有樣品都先通過一個0.45μm針筒式過濾器過濾。這是一個有效除往被測樣品中顆粒物的方法。但是這個過程也有一點需要關(guān)注：你使用了針筒式過濾器就不可能100%得到通過過濾器的被測樣品，總會有或多或少的丟失。丟失來自這樣幾方面：過濾器濾膜的吸附、過濾器濾出的顆粒物上的吸附、針筒式濾膜過濾器與針筒連接處的滲漏等。假如有丟失，過濾后液體中被測物的含量或濃度與原基本樣液的含量或濃度還相同嗎？這個題目一般需要通過實驗確認(rèn)。確認(rèn)這步是要增加工作量和用度的。過濾器的使用是一種消耗，每個過濾器的價格從幾元到十幾元。但在做食品中殘留物分析時，由于基質(zhì)大多比較復(fù)雜，所以過濾這步已成為不可或缺的一步。在實際分析工作中，一般檢測每一組樣品會帶一個外標(biāo)、一個添加回收或是質(zhì)控樣品，所以，只要終極檢測時得到的信噪比能滿足檢出限要求，可將這步視為系統(tǒng)誤差而忽略?！ ?、活動相 假如活動相均由高效液相色譜級溶劑組成，活動相沒有必要過濾。這是由于高效液相色譜級的有機溶劑，例如乙腈、甲醇等，在制造的工藝過程中都已經(jīng)過了0.2μm微孔濾膜過濾。同樣的，無論你是買的高效液相色譜儀HPLC級的水還是在實驗室使用超純水凈化系統(tǒng)制備的水，最后一步也是通過0.2μm微孔濾膜。然而，假如有任何一種緩沖液中加進了固體物，例如磷酸鹽，活動相過濾將是必要的一個步驟。固然緩沖鹽可能是可溶解的、高純的，但它還是可能含有顆粒物質(zhì)，例如在蓋試劑瓶的塑料內(nèi)蓋時，塑料瓶蓋子與瓶口邊沿擠壓就會產(chǎn)生塑料顆粒。在這種情況下，添加的一種固體物可能完全溶解了，但是少量雜質(zhì)顆粒存在于活動相中成為殘渣?！ 』顒酉嗤ㄟ^0.45μm微孔濾膜過濾對于從活動相中除往所有顆粒物是一個有效方法。0.2μm微孔濾膜也可以用，但是它們就這個應(yīng)用而言并不比0.45μm微孔濾膜更有效，而且它的過濾速度會更慢，特別是當(dāng)實驗室使用的試劑和水的質(zhì)量不太好時。建議實驗室在編寫制定他們活動相制備標(biāo)準(zhǔn)操縱程序（SOPs）時規(guī)定，可以鑒戒國際上同類實驗室的規(guī)定，即： 活動相制備僅采用HPLC級液體時不需要過濾，反之所有活動相組成在使用前必須過濾?！ ≡谶B接儲液瓶和泵的輸液管的末端進口采用下沉式過濾器（常見材質(zhì)有熔融玻璃砂芯濾板和微孔金屬的兩種）也是很重要的。這個過濾器的規(guī)格為≥10μm的微孔物質(zhì)，所以它不能取代活動相過濾步驟，但是它能除往系統(tǒng)中的塵土并保證儲液瓶、輸液管使用的可靠性。 3、儀器系統(tǒng)部件的磨損物 最后，在高效液相色譜儀HPLC系統(tǒng)中顆粒物的另一個主要來源是輸液泵密封墊和進樣閥旋轉(zhuǎn)軸的磨損。關(guān)于輸液泵密封墊的磨損更換有兩種不同建議?！ 〉谝环N建議以為，在一般實驗室中輸液泵密封墊通常使用壽命為六個月到一年，因此建議半年或一年更換這些密封墊，實驗室應(yīng)基于上述觀點制定定期預(yù)防性維護計劃。該觀點以為：與輸液泵密封墊顆粒堵塞柱子而更換新柱子的用度相比，更換密封墊的用度低些。一些輸液泵有玻璃砂芯或篩網(wǎng)，可在流路中濾掉從泵密封墊磨損下來的顆粒物，防止這些顆粒物隨活動相流至柱頭。若有這種裝置應(yīng)查閱輸液泵操縱手冊，查看推薦的這種過濾器清洗或更換的間隔?！ ×硪环N建議則以為，原裝密封墊的密封效果可以，更換以后輕易引起活動相滲漏。所以，只要不漏液就不要輕易更換密封墊?！ 煞N說法都有其道理，具體如何操縱，建議與儀器公司工程師溝通，各公司的儀器還是有些不同的?！ ∽詣舆M樣器旋轉(zhuǎn)軸的密封隨著使用時間也會磨損，但是在我的經(jīng)驗中，即便是高負(fù)荷的運轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)軸密封墊也可以使用幾年。假如你的自動進樣器系統(tǒng)有計數(shù)進樣閥轉(zhuǎn)動次數(shù)的功能，你可以設(shè)定一個警鈴當(dāng)預(yù)設(shè)閥轉(zhuǎn)動次數(shù)已達到時提醒你。曾有一種說法，進樣器較多轉(zhuǎn)動20,000次，這僅僅是進樣10000個；但這似乎不是實驗室涉及的常規(guī)樣品分析使用壽命，它們的實際使用壽命會更長。旋轉(zhuǎn)軸密封磨損后會滲液，比較明顯的特征是同一樣品多次進樣后，峰面積值差別比較大（RSD>?5%）。當(dāng)然，輸液泵的密封墊和旋轉(zhuǎn)軸的密封墊磨損將增加更多研磨物在活動相中，加速對這些部件的損傷。此外，假如你日常運行的活動相有緩沖鹽，如磷酸緩沖鹽，密封墊的磨損會更快?！ o論顆粒物源于何物，實驗時都要將其除往。推薦在HPLC系統(tǒng)中采用一個0.45或0.5μm的在線多孔過濾器，接在自動進樣器和柱子之間，即使已使用了保護柱。這個在線過濾器將成為擋板代替柱頭的濾板，而且如采用一個玻璃砂芯濾板，既便宜，更換又方便（幾分鐘就可更換）。若采用在線過濾，高效液相色譜儀檢測每批樣品開始前記錄下壓力值，當(dāng)壓力上升一定值，例如25%或增加500psi，應(yīng)該更換玻璃砂芯濾板了，更換以后沖洗幾分鐘系統(tǒng)將恢復(fù)到原來的壓力值。
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