液相色譜儀系統(tǒng)由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。
儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進樣器進入流動相；
被流動相載入色譜柱（固定相）內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)；
在兩相中作相對運動時，經(jīng)過反復多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別；
被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀；
數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來高效液相色譜儀主要有進樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；
下面將分別敘述其各自的組成與特點。
進樣系統(tǒng)
一般采用隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作，進樣量是恒定的。
這對提高分析樣品的重復性是有益的。
輸液系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。
高壓泵的一般壓強為47～44X10Pa，流速可調(diào)且穩(wěn)定，當高壓流動相通過層析柱時；
可降低樣品在柱中的擴散效應，可加快其在柱中的移動速度；
這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。
流動相貯存器和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變；
包括改變洗脫液的極性、離子強度、PH值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。
這就可使各種物質(zhì)（即使僅有一個基團的差別或是同分異構(gòu)體）都能獲得有效分離。
分離系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。
色譜柱一般長度為10～50cm（需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管）；
內(nèi)徑為2～5mm，由"優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成；
住內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質(zhì)和固定液構(gòu)成）。
固定相中的基質(zhì)是由機械強度高的樹脂或硅膠構(gòu)成；
它們都有惰性（如硅膠表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔徑可達1000?）和比表面積大的特點；
加之其表面經(jīng)過機械涂漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣）；
或者用化學法偶聯(lián)各種基因（如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體的有機化合物。
因此，這類固定相對結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性。
例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。
另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴散效應。
基質(zhì)粒度小，微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。
根據(jù)柱效理論分析，基質(zhì)粒度小，塔板理論數(shù)N就越大。
這也進一步證明基質(zhì)粒度小，會提高分辨率的道理。
再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60C；
通過改善傳質(zhì)速度，縮短分析時間，就可增加層析柱的效率。
流動相相當于液相的血液，可以想象對液相的重要程度。那么流動相都需要注意什么呢? 01、過濾溶劑 溶劑在使用前一定要用0.5μm的過濾器過濾，如果使用固體化學試劑(緩沖鹽)配制流動相，過濾特別重要，不能讓固體微粒污染泵，阻塞進樣器和柱頭過濾片。本實驗室有水溶性和脂溶性兩種過濾膜供選擇(反光面朝上)，過濾水溶性流動相時(如甲醇/水)，先用1～2mL甲醇潤濕過濾膜，有助于快速抽濾。 02、保持儲液瓶的清潔 用普通溶劑瓶作流動相儲液器應不定期廢棄瓶子，最后一次應用HPLC級的水或溶劑清洗，不能在清洗過程中留下污跡。 03、保證溶劑的質(zhì)量 一定要用HPLC級的溶劑，水也應達到HPLC級，同樣也要使用高純度的緩沖鹽。 一些因流動相引起的常見問題 01、流動相脫氣不充分 流動相受熱，或者流動相不同組分混合時會有氣體產(chǎn)生，氣泡進入泵內(nèi)引起壓力波動，增加噪音，色譜圖上出現(xiàn)毛刺?？稍囉孟铝蟹椒ń鉀Q問題：流動相再脫氣;采用更有效的脫氣方法或兩種方法配合使用;改系統(tǒng)內(nèi)混合為系統(tǒng)外預混合?！ ?2、流動相供給不暢 流動相用完，管道中吸入氣體引起泵壓力不穩(wěn)。應經(jīng)常觀察儲液器中流動相的量，加足流動相保證所有的樣品分析完畢。輸液管道上裝沉子沉至瓶底，儲液器蓋上留一小孔正好夾住進液管，使其不能上下移動。 過濾器阻塞引起管道和泵腔空化，壓力不穩(wěn)。過濾器被微粒所阻塞或長霉，去掉過濾器后如果系統(tǒng)運轉(zhuǎn)正常，說明已找出問題，換上新的過濾器則可。有時候換上新的過濾器仍然不暢，那就需要查查流動相的制備過程，或者換大孔徑的過濾器。不管如何，流動相都需要重新過濾。 流速過高、阻力大，造成空化現(xiàn)象，這是由于過濾器孔徑、管道內(nèi)徑、流速和溶劑黏度等引起的。如果流速大于10mL/min，常會出現(xiàn)這種現(xiàn)象?！ ∈褂孟铝蟹椒ń鉀Q： (1)使用低流速; (2)換大孔徑的過濾器; (3)增加進液管道內(nèi)徑; (4)抬高或加壓儲液器; (5)不用過濾器，但流動相一定要先過濾; (6)儲液器蓋子太緊，在儲液器內(nèi)形成真空，打出的流動相不連續(xù)。應松開蓋子或留有1mm的縫隙; (7)進液管道阻塞或彎曲使泵抽不到液，注意調(diào)整進液管道或更換新的。其它問題包括滲漏或接頭松動、泵部件損壞等，都能引起供液不正常?！ ?3、流動相和儲液器被污染 由于污染，噪音越來越大，檢測器基線上升。污染物可能被泵以穩(wěn)定的濃度打入系統(tǒng)，而再以穩(wěn)定的濃度流出來，所以在色譜圖中不出多余的峰。用梯度洗脫時弱流動相可以使污染物聚在柱頂，流動相強度增加后污染物可能被洗脫出來一個大的偽峰。有時基線噪音突然增大或突然提高，都是因為反復加進新的流動相或系統(tǒng)用得太久(通宵)所造成的。新加進的流動相有污染物或者流動相長霉，繁殖了細菌。 臟的儲液器會污染清潔的流動相。每種流動相備有專用的儲液器，或者定期報廢儲液器?！ ×鲃酉辔廴緛碜赃@幾個方面 04、試劑質(zhì)量不高，玻璃器皿不合格; 微生物的影響; 配制流動相時操作不當?shù)? 因此要求高純度化學試劑和HPLC級溶劑; 玻璃器皿按規(guī)定清洗干凈; 為防止微生物生長，每天要用甲醇清洗系統(tǒng); 懷疑系統(tǒng)內(nèi)生長了微生物，可用稀硝酸沖洗即可(注意不要損壞柱和管道系統(tǒng)); 真空脫氣時防止泵油帶入流動相; 用清潔的惰性塞子、攪棒、過濾器和玻璃器皿配制流動相; 已經(jīng)污染的流動相一定要廢棄掉。
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