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液相色譜分析法和氣相色譜法的區(qū)別 液相色譜解決方案

時(shí)間:2020-05-17    來源:儀多多儀器網(wǎng)    作者:儀多多商城     
  液相色譜法與氣相色譜法一樣,都屬于色譜法,具有選擇性高、分離效率高、靈敏度高、分析速度快等特點(diǎn)。下面就兩種色譜法的應(yīng)用范圍、儀器構(gòu)造等不同點(diǎn)進(jìn)行比較。
 
  一、氣相與液相的概念
 
  氣相
 
  氣相色譜是一種物理的分離方法。利用被測物質(zhì)各組分在不同兩相間分配系數(shù)(溶解度)的微小差異,當(dāng)兩相作相對運(yùn)動(dòng)時(shí),這些物質(zhì)在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次的分配使原來只有微小的性質(zhì)差異產(chǎn)生很大的效果而使不同組分得到分離。
 
  液相
 
  液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上引用了氣相色譜的理論。在技術(shù)上,流動(dòng)相改為高壓輸送;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成,從而,使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜(每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬);同時(shí),柱后連有高靈敏度的檢測器可對流出物進(jìn)行連續(xù)檢測。
 
  二、應(yīng)用范圍
 
  氣相
 
  有著分離能力好、靈敏度高、分析速度快、操作方便等特點(diǎn)。受技術(shù)條件的限制,沸點(diǎn)太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng)用氣相色譜法進(jìn)行分析,一般對500℃以下不易揮發(fā)或受熱易分解的物質(zhì)部分可采用衍生化法或裂解法。
 
  液相
 
  液相色譜法,只要求試樣能制成溶液,而不需要?dú)饣?,因此,不受試樣揮發(fā)性的限制。對于高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、相對分子量大(大于400以上)的有機(jī)物(些物質(zhì)幾乎占有機(jī)物總數(shù)的75%~80%)。原則上,都可應(yīng)用液相色譜法來進(jìn)行分離、分析。據(jù)統(tǒng)計(jì),在已知化合物中能用氣相色譜分析的約占20%,而能用液相色譜分析的約占70~80%。
 
  三、氣相儀器構(gòu)造
 
  由載氣源、進(jìn)樣部分、色譜柱、柱溫箱、檢測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。進(jìn)樣部分、色譜柱和檢測器的溫度均在控制狀態(tài)。
 
  1.柱箱:
 
  色譜柱是氣相色譜儀的心臟,樣品中的各個(gè)組份在色譜柱中經(jīng)過反復(fù)多次分配后得到分離,從而達(dá)到分析的目的,柱箱的作用就是安裝色譜柱。由于色譜柱的兩端分別連接進(jìn)樣器和檢測器,因此,進(jìn)樣器和檢測器的下端(接頭)均插入柱箱。柱箱能夠安裝各種填充柱和毛細(xì)管柱并且操作方便。色譜柱(樣品)需要在一定的溫度條件下工作,因此,采用微機(jī)對柱箱進(jìn)行溫度控制,并且由于設(shè)計(jì)合理,柱箱內(nèi)的梯度很小。
 
  對于一些成份復(fù)雜、沸程較寬的樣品,柱箱還可進(jìn)行三階程序升溫控制。且程序設(shè)定后自動(dòng)運(yùn)行無需人工干預(yù),降溫時(shí)還能自動(dòng)后開門排熱。
 
  2.進(jìn)樣器:
 
  進(jìn)樣器的作用是將樣品送入色譜柱。如果是液體樣品,進(jìn)樣器還必須將其汽化。因此,采用微機(jī)對進(jìn)樣器進(jìn)行溫度控制。
 
  根據(jù)不同種類的色譜柱及不同的進(jìn)樣方式,共有五種進(jìn)樣器可供選擇:
 
  填充柱進(jìn)樣器
 
  毛細(xì)管不分流進(jìn)樣器附件
 
  毛細(xì)管分流進(jìn)樣器附件
 
  毛細(xì)管分流/不分流進(jìn)樣器
 
  六通閥氣體進(jìn)樣器
 
  3.檢測器:
 
  檢測器的作用是將樣品的化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為物理信號(電信號)。
 
  檢測器也需要在一定的溫度條件下才能正常工作,因此,采用微機(jī)對檢測器進(jìn)行溫度控制。
 
  根據(jù)各種樣品的化學(xué)物理特性,共有五種檢測器可供選擇:
 
  氫火焰離子化檢測器(FID);
 
  熱導(dǎo)檢測器(TCD);
 
  電子捕獲檢測器(ECD);
 
  氮磷檢測器(NPD);
 
  火焰光度檢測器(FPD);
 
  4.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng):
 
  該系統(tǒng)可對測試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作,使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。
 
  四、液相儀器構(gòu)造
 
  液相色譜儀主要有:進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。
 
  1.進(jìn)樣系統(tǒng)
 
  一般采用:隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作,進(jìn)樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。
 
  2.輸液系統(tǒng)
 
  該系統(tǒng)包括高壓泵、流動(dòng)相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為l.47~4.4×107Pa流速可調(diào)且穩(wěn)定,當(dāng)高壓流動(dòng)相通過層析柱時(shí),可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng),可加快其在柱中的移動(dòng)速度,這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動(dòng)相貯存錯(cuò)和梯度儀,可使流動(dòng)相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變,包括改變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、pH值。
 
  3.分離系統(tǒng)
 
  該系統(tǒng)包括:色譜柱、連接管和恒溫器等。
 
  色譜柱一般長度為10~50cm(需要兩根連用時(shí),可在二者之間加一連接管)內(nèi)徑為2~5mm,由不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成,柱內(nèi)裝有直徑為5~10μm粒度的固定相(由基質(zhì)和固定液構(gòu)成),固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹脂或硅膠構(gòu)成,它們都有惰性(如,硅膠表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性和比表面積大的特點(diǎn),加之其表面經(jīng)過機(jī)械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣)或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因(如,磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等)或配體的有機(jī)化合物。
 
  因此,這類固定相對結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性,例如,在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素(PSA)后,就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來。
 
  另外,固定相基質(zhì)粒小,柱床極易達(dá)到均勻、致密狀態(tài),極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)?;|(zhì)粒度小、微孔淺,樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論分析,基質(zhì)粒度小,塔板理論數(shù)N就越大。
 
  這也進(jìn)一步證明基質(zhì)粒度小,會(huì)提高分辨率的道理。再者,液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60℃通過改善傳質(zhì)速度,縮短分析時(shí)間,就可增加層析柱的效率。
 
  4.檢測系統(tǒng)
 
  液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種:
 
  (1)紫外檢測器
 
  該檢測器適用于對紫外光(或可見光)有吸收性能樣品的檢測。
 
  其特點(diǎn):使用面廣(如,蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用);靈敏度高(檢測下限為10-10g/mL);線性范圍寬;對溫度和流速變化不敏感;可檢測梯度溶液洗脫的樣品。
 
  (2)示差折光檢測器
 
  凡具有與流動(dòng)相折光率不同的樣品組分,均可使用示差折光檢測器檢測;糖類化合物的檢測使用此檢測系統(tǒng)。這一系統(tǒng)通用性強(qiáng)、操作簡單,但是,靈敏度低(檢測下限為10-7g/mL),流動(dòng)相的變化會(huì)引起折光率的變化;因此,它既不適用于痕量分析,也不適用于梯度洗脫樣品的檢測。
 
  (3)熒光檢測器
 
  凡具有熒光的物質(zhì),在一定條件下,其發(fā)射光的熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比。因此,這一檢測器只適用于具有熒光的有機(jī)化合物(如,多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質(zhì)等。。。)的測定,其靈敏度很高(檢測下限為10-12~10-14g/mL)痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可采用。
 
  5.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
 
  該系統(tǒng)可對測試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作,使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。
 
  五、液相色譜與氣相色譜法優(yōu)點(diǎn)和不足分析
 
  只有20%樣品可不經(jīng)化學(xué)處理而能滿意地用氣相色譜分離,80%的有機(jī)化合物要用液相色譜分析。
 
  氣相色譜中流動(dòng)相是惰性的,它對組分沒有作用力,僅起運(yùn)載作用、而液相色譜的流動(dòng)相不僅起運(yùn)載作用,而且流動(dòng)相對組分有一定親合力,可以通過改變流動(dòng)相種類和組成提高分離的選擇性;另外,可作流動(dòng)相的化合物多,選擇余地廣。
 
  與氣相色譜相比,液相色譜儀的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是:樣品的回收比較容易,只要開口容器放在柱子末端,就可以很容易地將所分離的各組分收集?;厥帐嵌康模梢杂脕硖峒兒椭苽渚哂凶銐蚣兌鹊膯我晃镔|(zhì)。
 
  液相色譜不足的是,日前,檢測器的靈敏度不及氣相色譜。必須特別注意“柱外效應(yīng)”對柱效率及色譜分離的影響。

當(dāng)液相色譜儀出現(xiàn)故障時(shí)我們?nèi)绾巫詸z?

    液相色譜儀在人們的生活中占有很大一部分,但是由于沒有認(rèn)真的看說明書,導(dǎo)致一些操作上的問題,使液相色譜儀的使用壽命變短,那到底出現(xiàn)故障我們改怎么解決呢,這篇文章就是針對這個(gè)問題來進(jìn)行討論的。

    1、氣泡溢出

    流動(dòng)相內(nèi)有氣泡,關(guān)閉泵,打開泄壓閥,打開purg鍵,清洗脫氣,氣泡不斷從過濾器冒出,進(jìn)入流動(dòng)相,無論打開purge鍵幾次,都無法清除不斷產(chǎn)生的氣泡。原因過濾器長期沉浸于乙酸銨等緩沖液內(nèi),過濾器內(nèi)部由于霉菌的生長繁殖,形成菌團(tuán),阻塞了過濾器,緩沖液難以流暢地通過過濾器,空氣在泵的壓力作用下經(jīng)過濾器進(jìn)入流動(dòng)相。處理過濾器浸泡于5%硝酸溶液中,超聲清洗幾分鐘即可;亦可將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中12~36小時(shí),輕輕震蕩幾次,再將過濾器用純水清洗幾次,打開泄壓閥,打開purge鍵清洗脫氣,如仍有氣泡不斷從過濾器冒出,繼續(xù)將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中,如沒有氣泡不斷從過濾器中冒出,說明過濾器內(nèi)部的霉菌菌團(tuán)已被硝酸破壞,流動(dòng)相可以流暢地通過過濾器。打開泄壓閥,打開泵,流速調(diào)至1.0~3.0ml/min,純水沖洗過濾器1小時(shí)左右。即可將過濾器清洗干凈。關(guān)閉泄壓閥,純甲醇沖洗半小時(shí)即可。

    2、峰面積重復(fù)性不佳

    (1)進(jìn)樣閥漏液。

    (2)加樣針不到位。

    (3)液量不足。處理對于第一種情況更換進(jìn)樣閥墊圈;對于第二種情況保證加樣針插到底,注射樣品溶液后須快速、平穩(wěn)地從LOAD狀態(tài)轉(zhuǎn)換到INJECT狀態(tài),以保證進(jìn)樣量的準(zhǔn)確。日常工作中,液相色譜儀的保養(yǎng)非常重要,如要注意不要讓空氣進(jìn)入輸液系統(tǒng)和高壓泵中,儲液器內(nèi)的溶液如長時(shí)間未用應(yīng)清洗儲液器并更換溶液,每次用完色譜儀后緩沖液要用純水沖洗干凈,防止無機(jī)鹽析出或沉積;樣品的前處理也很重要,任何樣品都要盡可能地去除雜質(zhì),完全溶解,盡量減少對色譜柱的污染,以延長色譜柱的使用壽命,同時(shí)避免注射過濃的樣品溶液,以免殘留液在進(jìn)樣閥內(nèi)析出固體引起堵塞;色譜柱作好標(biāo)記,用于不同分析目的的色譜柱不要混用等。

    3、柱壓高原因

    (1)緩沖液鹽分如(乙酸銨等)沉積于柱內(nèi)。

    (2)樣品污染沉積。處理對于第一種情況先用40~50℃的純水,低速正向沖洗柱子,待柱壓逐漸下降后,相應(yīng)提高流速?zèng)_洗,柱壓大幅度下降后,用常溫純水沖洗,之后用純甲醇沖洗柱子30分鐘;對于第二種情況,由樣品的沉積引起污染的C18柱,和純水反向沖洗柱子,然后換成甲醇沖洗,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時(shí)間的長短由樣品污染的情況而定),再用換成甲醇沖洗,然后用純水沖洗,最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。

    4、既無壓力指示,又無液體流過

    (1)泵密封墊圈磨損。

    (2)大量氣泡進(jìn)入泵體。處理對于第一種情況,更換密封墊圈;對于第二種情況,在泵作用的同時(shí),用一個(gè)50ml的玻璃針筒在泵的出口處幫助抽出空氣。

    5、壓力波動(dòng)大,流量不穩(wěn)定

    原因系統(tǒng)中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物,使得兩者不能密封。處理工作中注意觀察流動(dòng)相的量,保證不銹鋼濾器沉入儲液器瓶底,避免吸入空氣,流動(dòng)相要充分脫氣。如為單向閥和閥座之間夾有異物,拆下單向閥,放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗。

    6、出峰不佳,峰分叉

    (1)色譜柱被污染。

    (2)柱頭填料塌陷。處理對于第一種情況,先用純水反向沖洗柱子,然后換成甲醇沖洗,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時(shí)間的長短由樣品污染的情況而定),再換成甲醇沖洗,然后用純水沖洗,最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。如沖洗后依然出峰不佳,則考慮第二種情況。對于第二種情況,擰開柱頭,檢查柱填料是否硬結(jié)或塌陷。去除硬結(jié)部分(污染的填料),裝入新填料,滴一滴甲醇,填料下陷,再填,用與柱內(nèi)徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊,再填平,滴甲醇,再壓緊反復(fù)幾次,直至裝滿填平。柱頭用甲醇沖洗干凈,擦凈柱外壁的填料,擰緊柱頭,用純甲醇沖洗30分鐘以上。

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液相色譜儀 當(dāng)液相色譜儀出現(xiàn)故障時(shí)我們?nèi)绾巫詸z?_液相色譜儀

液相色譜儀常見四種故障處理方法

  1、出峰不佳,峰分叉 ?。?)色譜柱被污染?! 。?)柱頭填料塌陷。處理對于第一種情況,先用純水反向沖洗柱子,然后換成甲醇沖洗,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時(shí)間的長短由樣品污染的情況而定),再換成甲醇沖洗,然后用純水沖洗,最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。如沖洗后依然出峰不佳,則考慮第二種情況。對于第二種情況,擰開柱頭,檢查柱填料是否硬結(jié)或塌陷。去除硬結(jié)部分(污染的填料),裝入新填料,滴一滴甲醇,填料下陷,再填,用與柱內(nèi)徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊,再填平,滴甲醇,再壓緊反復(fù)幾次,直至裝滿填平。柱頭用甲醇沖洗干凈,擦凈柱外壁的填料,擰緊柱頭,用純甲醇沖洗30分鐘以上?! ?、柱壓高原因 ?。?)緩沖液鹽分如(乙酸銨等)沉積于柱內(nèi)。 ?。?)樣品污染沉積。處理對于第一種情況先用40~50℃的純水,低速正向沖洗柱子,待柱壓逐漸下降后,相應(yīng)提高流速?zèng)_洗,柱壓大幅度下降后,用常溫純水沖洗,之后用純甲醇沖洗柱子30分鐘;對于第二種情況,由樣品的沉積引起污染的C18柱,和純水反向沖洗柱子,然后換成甲醇沖洗,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時(shí)間的長短由樣品污染的情況而定),再用換成甲醇沖洗,然后用純水沖洗,最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上?! ?、壓力波動(dòng)大,流量不穩(wěn)定  原因系統(tǒng)中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物,使得兩者不能密封。處理工作中注意觀察流動(dòng)相的量,保證不銹鋼濾器沉入儲液器瓶底,避免吸入空氣,流動(dòng)相要充分脫氣。如為單向閥和閥座之間夾有異物,拆下單向閥,放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗?! ?、既無壓力指示,又無液體流過  (1)泵密封墊圈磨損。 ?。?)大量氣泡進(jìn)入泵體。處理對于第一種情況,更換密封墊圈;對于第二種情況,在泵作用的同時(shí),用一個(gè)50ml的玻璃針筒在泵的出口處幫助抽出空氣。

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