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液相色譜儀HPLC分析方法驗證 液相色譜解決方案

時間:2020-05-17    來源:儀多多儀器網(wǎng)    作者:儀多多商城     
  為了保證分析檢測結(jié)果準確、可靠,必須對所采用的分析方法的準確性、科學性和可行性進行驗證,以證明分析方法符合檢測的目的和要求,這就是分析方法驗證。從本質(zhì)上講,方法驗證就是根據(jù)檢測項目的要求,預先設(shè)置一定的驗證內(nèi)容,并通過設(shè)計合理的試驗來驗證所采用的分析方法符合檢測項目的要求。方法驗證在質(zhì)量控制上有重要的作用和意義,只有經(jīng)過驗證的分析方法才能用于藥品生產(chǎn)的分析檢測,方法驗證是制訂質(zhì)量標準的基礎(chǔ)。方法驗證內(nèi)容包括方法的專屬性、線性、范圍、準確度、精密度、檢出限、定量限、耐用性和系統(tǒng)適用性等,檢測目的不同驗證要求也不盡相同。
 
  1.專屬性
 
  專屬性是指分析方法能夠?qū)a(chǎn)品和雜質(zhì)分開的特性,也稱為選擇性。對于純度檢測,可在標準品中加入產(chǎn)品中的已知雜質(zhì),或者直接用粗品,考察產(chǎn)品峰是否受到雜質(zhì)的干擾,對于過程跟蹤,可用反應(yīng)體系樣品來考察有沒有其它的雜質(zhì)干擾。必要時使用二極管陣列檢測器或者質(zhì)譜檢測器進行色譜峰純度檢查。一般要求產(chǎn)品和雜質(zhì)之間的分離度大于2.0。
 
  2.線性
 
  線性是在設(shè)定的范圍內(nèi),檢測結(jié)果與樣品中原料或產(chǎn)品的濃度呈線性關(guān)系的程度。線性是定量檢測的基礎(chǔ),需要定量檢測的項目都需要驗證線性。一般用貯備液經(jīng)過精密稀釋,或分別精密稱樣,制備得到一系列被測物質(zhì)的濃度(5個以上),按濃度從小到大運行序列,以峰面積和濃度的函數(shù)作圖,用zui小二乘法進行線性回歸計算,考察分析方法的線性。
 
  3.范圍
 
  范圍指在能夠達到一定的準確度、精密度和線性時,樣品中被分析物的濃度區(qū)間。簡單的說,范圍就是分析方法適用的樣品中待測物的濃度zui大值和zui小值。需要定量檢測的分析方法都需要對范圍進行驗證,純度檢測時,范圍應(yīng)為測試濃度的80%~120%。
 
  4.準確度
 
  準確度是指測定的結(jié)果與真實值之間接近的程度,所以也叫做真實度,需要定量得分析方法均需要驗證準確度。準確度應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)建立,對于原料藥可用已知純度的標準品或符合要求的原料藥進行測定,必要時可與另一個已建立準確度的方法比較結(jié)果。
 
  5.精密度
 
  精密度是指在規(guī)定條件下,同一均勻樣品經(jīng)多次取樣進行一系列檢測所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用相對標準偏差表示,取樣檢測次數(shù)應(yīng)至少6次。
 
  精密度可以從三個層次考察:重復性、中間精密度、重現(xiàn)性。
 
  a、重復性是在相同的操作條件下、較短時間間隔內(nèi),由同一分析人員測定所得結(jié)果的精密度。一般是用100%濃度水平的樣品測定6次的結(jié)果進行評價。
 
  b、中間精密度:同一實驗室,在日期、分析人員、儀器等內(nèi)部條件改變時,測定結(jié)果的精密度。
 
  c、重現(xiàn)性:指不同實驗室之間不同分析人員測定結(jié)果的精密度。
 
  6.檢出限
 
  檢出限是指樣品中的被分析物能夠被檢測到的zui低量,不需要準確定量。檢出限體現(xiàn)了分析方法的靈敏度。檢出限的測定可以通過對一系列已知濃度被測物的試樣進行檢測,以能準確、可靠檢出被測物的zui小濃度來確定,也可把已知濃度樣品的信號與噪聲信號進行比較,以信噪比為3:1時的濃度確定檢出限,一般要求能夠達到進樣濃度的0.05%。
 
  7.定量限
 
  定量限是指樣品中的被分析物能夠被定量檢測的zui低量,其測定結(jié)果需要一定的準確度和精密度,定量限體現(xiàn)了分析方法靈敏定量檢測的能力。檢測需要嚴格控制含量的雜質(zhì),必須考察方法的定量限,以保證雜質(zhì)能夠被準確定量。一般以信噪比為10:1時相應(yīng)的濃度或進樣量來確定定量限。
 
  8.耐用性
 
  耐用性是指測定條件發(fā)生小的變動時,測定結(jié)果不受影響的承受程度,耐用性主要表明方法的抗干擾能力,主要的變動因素包括:流動相的組成、流速和pH值、色譜柱、柱溫等。經(jīng)試驗,應(yīng)說明小的變動能否符合系統(tǒng)適用性試驗要求,以確保方法有效。
 
  9.系統(tǒng)適用性試驗
 
  液相色譜分析方法主要依賴液相色譜儀和色譜柱,在做方法驗證時,有必要將液相色譜儀、色譜柱、流動相與實驗操作、待測樣品等一起當作完整的系統(tǒng)進行評估,并將系統(tǒng)適用性作為分析方法的組成部分,系統(tǒng)適用性便是對整個系統(tǒng)進行評估的指標。一般系統(tǒng)適應(yīng)性的要求為:分析方法能夠達到0.05%的檢出限,主峰的拖尾因子0.5 
  分析方法開發(fā)與驗證是一個整體,在實際工作中,一般是先開發(fā)分析方法,經(jīng)過適當?shù)膬?yōu)化以后再做方法驗證,驗證的部分內(nèi)容在分析方法開發(fā)時就要做,比如說分析方法的專屬性驗證。分析方法驗證并非必須驗證所有的內(nèi)容,只要注意驗證內(nèi)容充分,足以證明分析方法的合理性就可以了,如雜質(zhì)限度檢測一般只需要驗證專屬性和檢出限,而精密度、線性、定量限等涉及定量測定的項目,則不需要驗證。
 
  有時需要對分析方法進行全面或部分的再驗證。當原料藥合成工藝發(fā)生改變時,可能引入新的雜質(zhì),雜質(zhì)檢查方法和含量測定方法的專屬性就需要再進行驗證,以證明有關(guān)物質(zhì)檢查方法能夠檢測新引入的雜質(zhì),且新引入的雜質(zhì)對主成份的含量測定應(yīng)無干擾。當分析方法發(fā)生部分改變時,如檢測波長發(fā)生改變,則需要重新進行檢測限、專屬性、準確度、精密度、線性等內(nèi)容的驗證,以證明改變后的分析方法的合理性、可行性。

高效液相色譜儀的組成及分類

  一. 高壓輸液系統(tǒng)

  貯液裝置、高壓輸液泵、過濾器、脫氣裝置等

  1. 貯液器:貯液器用于存放溶劑。溶劑必須很純,貯液器材料要耐腐蝕,對溶劑呈惰性。貯液器應(yīng)配有溶劑過濾器,以防止活動相中的顆粒進進泵內(nèi)。溶劑過濾器一般用耐腐蝕的鎳合金制成,空隙大小一般為2mm。

  2. 脫氣裝置:脫氣的目的是為了防止活動相從高壓柱內(nèi)流出時,開釋出氣泡進進檢測器而使噪聲劇增,甚至不能正常檢測。

  3. 高壓輸液泵  高壓輸液泵是高效液相色譜儀的重要部件,是驅(qū)動溶劑和樣品通過色譜柱和檢測系統(tǒng)的高壓源,其性能好壞直接影響分析結(jié)果的可靠性。

  對高壓泵的基本要求是:

  ①流量穩(wěn)定;②輸出壓力高,最高輸出壓力為50Mpa;③流量范圍寬,可在0.01~10ml/min范圍任選。④耐酸、堿、緩沖液腐蝕。⑤壓力波動小。

  2. 梯度洗脫裝置  梯度洗脫是利用兩種或兩種以上的溶劑,按照一定時間程序連續(xù)或階段地改變配比濃度,以達到改變活動相極性、離子強度或pH值,從而進步洗脫能力,改善分離的一種有效方法。當一個樣品混合物的容量因子是范圍很寬,用等度洗脫時間太長,且后出的峰形扁平不便檢測時,用梯度洗脫可以改善峰形、并縮短分離時間。HPLC的梯度洗脫與GC的程序升溫相似,可以縮短分析時間,進步分離效果。使所有的峰都處于較佳分離狀態(tài),而且峰形尖而窄。

  二. 進樣器

  進樣器一般要求密封性好,死體積小,重復性好,保證中心進樣,進樣時對色譜系統(tǒng)的壓力和流量波動小,并便于實現(xiàn)自動化。

  高壓進樣閥是目前廣泛采用的一種方式。閥的種類很多,有六通閥、四通閥,雙路閥等。以六通進樣閥較為常用。

  三.分離系統(tǒng)

  色譜分離系統(tǒng)包括色譜柱、固定相和活動相。色譜柱是其核心部分,柱應(yīng)具備耐高壓、耐腐蝕、抗氧化、密封不漏液和柱內(nèi)死體積小、柱效高、柱容量大、分析速度快、柱壽命長的要求。通常采用優(yōu)質(zhì)不銹鋼管制成。

  色譜柱按內(nèi)徑不同可分為常規(guī)柱、快速柱和微量柱三類。

  常規(guī)分析柱柱長一般為10~25cm,內(nèi)徑4 ~ 5mm,固定相顆粒直徑為 5 ~ 10 mm。為了保護分析柱不受污染,一般在分析柱前加一短柱,約數(shù)厘米長,稱為保護柱。

  (微量分析柱內(nèi)徑小于l mm,凝膠色譜往內(nèi)徑3~12 mm,制備往內(nèi)徑較大,可達25 mm以上。)

  四. 檢測系統(tǒng)

  檢測器的作用是將柱流出物中樣品組成和含量的變化轉(zhuǎn)化為可供檢測的信號,常用檢測器有紫外吸收、熒光、示差折光、化學發(fā)光等。

標簽: 高效液相色譜儀
高效液相色譜儀 高效液相色譜儀的組成及分類_高效液相色譜儀

液相色譜柱怎么安裝?

    液相色譜柱是一種用于液體色譜分析儀器,其結(jié)構(gòu)主要有:    a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。    柱接頭采用低死體積結(jié)構(gòu),柱接頭是兩端螺紋組件,一端是為7/16英寸外螺紋,另一端是3/16英寸的內(nèi)螺紋(國內(nèi)外已規(guī)范化)。7/16英寸外螺紋與1/4英寸柱管(Φ6.35mm)連接,中間放置壓壞用于密封。3/16英寸的內(nèi)螺紋與1/16英寸(Φ1.57mm)的連接管連接,中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封。為了盡量減少柱外死體積,在安裝色譜柱時,用Φ1.57mm連接管通過空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底,然后再擰緊空心螺釘。壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上(連接管通過壓環(huán)后露出的管長度應(yīng)嚴格控制在2.5mm長或其他固定尺寸)。    在兩端柱接頭內(nèi),柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片(或濾網(wǎng)),用于封堵柱填料不被流動相沖出柱外而流失??罩鹘M件均為316#不銹鋼材質(zhì),能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性,故使用時要注意,柱及連接管內(nèi)不能長時間存留此類溶劑,以避免腐蝕。    b、柱填料:    液相色譜柱的分離作用是在填料與流動相之間進行的,柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。    正相柱:多以硅膠為柱填料。根據(jù)外型可分為無定型和球型兩種,其顆粒直徑在3—10 ?m的范圍內(nèi)。另一類正相填料是硅膠表面鍵合—CN,-NH2等官能團即所謂的鍵合相硅膠。    反相柱:主要是以硅膠為基質(zhì),在其表面鍵合十八烷基官能團(ODS)的非極性填料。也有無定型和球型之分。    常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等,其顆粒粒徑在3—10 ?m之間。    安裝方法:    a、拆開柱包裝盒,確認色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內(nèi)貯存的溶劑。    b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。    c、 按柱管上標示的流動相流向,將色譜柱的入口端通過連接管與進樣閥出口相連接(如條件允許,建議在柱前使用保護柱);柱的出口與檢測器連接。連接管是外徑為1.57mm、內(nèi)徑為0.1-0.3mm的不銹鋼管。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。在接管時一定要設(shè)法降低柱外死體積。連接管通過空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底,然后順時針擰緊空心螺釘,直到擰不動為止,再用扳手繼續(xù)順時針擰1/4-1/2圈,切記不要用力過大。如色譜柱通過流動相加壓后有漏液現(xiàn)象,請用扳手繼續(xù)順時針擰1/4圈,直至不漏液為止。

標簽: 液相色譜柱
液相色譜柱 液相色譜柱怎么安裝?_液相色譜柱

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