高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。與經(jīng)典的液相色譜相比，具有高效液相所用的固定相粒度小（5um-10um）、傳質(zhì)快、柱效高的優(yōu)勢。近年來，在保健食品功效成分、營養(yǎng)強化劑、維生素類、蛋白質(zhì)的分離測定等應用廣泛。世界上約有80％的有機化合物可以用HPLC來分析測定。
高效液相色譜的分離過程HPLC，借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。
高效液相色譜儀操作步驟：
1)過濾流動相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜。
2)對抽濾后的流動相進行超聲脫氣10-20分鐘。
3)打開HPLC工作站(包括計算機軟件和色譜儀)，連接好流動相管道，連接檢測系統(tǒng)。
4)進入HPLC控制界面主菜單，點擊manual，進入手動菜單。
5)一段時間沒用，或者換了新的流動相，需要先沖洗泵和進樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽取。沖洗進樣閥，需要在manual菜單下，先點擊purge，再點擊start，沖洗時速度不要超過10ml/min。
6)調(diào)節(jié)流量，初次使用新的流動相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過2000。點擊injure，選用合適的流速，點擊on，走基線，觀察基線的情況。
7)設計走樣方法。點擊file，選取selectusersandmethods，可以選取現(xiàn)有的各種走樣方法。若需建立一個新的方法，點擊newmethod。選取需要的配件，包括進樣閥，泵，檢測器等，根據(jù)需要而不同。選完后，點擊protocol。一個完整的走樣方法需要包括：a.進樣前的穩(wěn)流，一般2-5分鐘；b.基線歸零；c.進樣閥的loading-inject轉(zhuǎn)換；d.走樣時間，隨不同的樣品而不同。
8)進樣和進樣后操作。選定走樣方法，點擊start。進樣，所有的樣品均需過濾。方法走完后，點擊postrun，可記錄數(shù)據(jù)和做標記等。全部樣品走完后，再用上面的方法走一段基線，洗掉剩余物。
9)關機時，先關計算機，再關液相色譜。
液相色譜儀常見的故障一是堵，二是漏。下面我們來談一下“堵”的情況。（注：流動相以甲醇為例，色譜柱以C18為例） “堵”的表現(xiàn)現(xiàn)象就是柱壓異常升高，直接原因就是流路不暢。堵塞的主要位置就是在色譜柱的前端，最主要原因就是流動相里有雜質(zhì)，雜質(zhì)的主要來源就是細菌?！ 岸隆钡脑蛑唬号渲屏鲃酉鄷r細菌污染 首先，我們要認識到，一般的國產(chǎn)甲醇其實不需要額外過濾處理，直接使用沒有問題。即使是有些固態(tài)微粒雜質(zhì)，也能在液相流路系統(tǒng)最前端的過濾頭上排除，真正容易引起問題的，是水中的細菌?！ ⌒轮苽涞募兯谑覂?nèi)放置幾天就會長菌，而這些細菌雖然肉眼不可見，卻足以堵塞柱填料顆粒的空隙，造成柱子很快報廢。這就是在配制流動相時造成的細菌污染的原因，解決它的方法很簡單，就是確保水的可靠性。這里有兩種方式推薦： ?。?）較為理想的方式當然是購買實驗室專用純水機，既方便又可靠，質(zhì)量也放心。唯一的缺點就是價格不菲?！ 。?）成箱購買市售品牌純凈水，如，500mL一支的怡寶或娃哈哈，這些水的質(zhì)量足以應付液相色譜的要求。先隨機抽取一支做一下細菌平板實驗，待菌落數(shù)合格方可使用。這樣每次只要單獨開一支即可，也很方便。每次成本2元左右?！ @里特別指出一個細節(jié)：在絕大多數(shù)書本上，凡談到配制流動相都會談到最后有一個過濾的步驟。但是從我們長期使用的實際效果來說，只要能保證水的質(zhì)量，這一步完全可以也應當去除?！ ≡蛴幸韵氯c： ?。?）流動相過濾在理論上有好處，但是，實際操作時由于不可能做到專瓶專用，反而容易造成的交叉污染，對于配比復雜的流動相影響更大?！ 。?）流動相過濾在經(jīng)濟成本上不劃算。買一套過濾裝置要6000多元，且過濾器公認是比較容易損壞的設備。最主要是過濾片的成本太高，一片就要幾十元。按一般液相柱的正常使用壽命計算，過濾片的成本會遠遠高于色譜柱的成本?！ 。?）流動相過濾對于工作效率成本不劃算。使用溶劑過濾器有一個預清洗、裝備、使用、用后清洗，晾干的過程，至少也有一個小時的時間。這個成本也不能忽視?！ 。?）在實際工作未發(fā)現(xiàn)流動相不過濾會對柱壽命有任何影響。我們起碼有6年時間沒有做過流動相過濾的工作，但是和國內(nèi)同行相比較，在同等使用強度下我們的柱壽命是比較長的?！ 岸隆钡脑蛑菏褂昧鲃酉鄷r的細菌污染?！ ≈傅氖牵骸 ×鲃酉鄤傞_始沒有長菌，在使用時卻產(chǎn)生了細菌污染。這主要是在使用多元液相色譜儀時的一種不良使用習慣造成的?！ ∨e比較簡單的例子： 50％的甲醇水流動相，有兩種使用方式。一種方式是在上機前就配好混合在一起，另一種方式是在流路A放純甲醇，流路B放純水?！ 膯渭儗嶒炐Ч麃碚f，后一種有明顯的優(yōu)點：首先是簡單，不需要實驗者另個計算配比混合，其次就是比例準確，能得到保留時間重復性極好的實驗效果?！ 〉牵幸粋€致命的缺陷，就是純水在流動相瓶中幾天時間就會長細菌（很多情況下不僅僅用純水作流動相，而是用緩沖鹽溶液，本身就是優(yōu)質(zhì)肥料，細菌長得更迅速），一旦有細菌柱子就壞得很快。所以這種方式要求操作人員每次實驗都要用新制備的純水，更要求在每次實驗后把水相換掉，換成甲醇沖洗干凈，這一點在實際工作中很多人意識不強，就是意識到了但多次使用中總有一兩次會遺漏，但是往往這一兩次就足以產(chǎn)生致命的影響。因為液相色譜柱的堵塞是不可逆的?！ ∷裕瑢幙蔂奚⌒〉谋Ａ魰r間的重復性，也不要用純水溶液作為流動相的一組。從實際實驗效果來說，我建議用10％的甲醇水代替純水溶液（以前我做過不同比例甲醇水的細菌總數(shù)實驗，在5％就基本可以抑菌，在10％及以上就可以完全殺菌了），這樣可以有效排除長細菌的隱患，既可作流動相，也可沖柱。就算是在配制流動相時會計算得麻煩一些，但是一次麻煩，終身受益。 “堵”的原因之三：不適當操作。 常見問題的有以下幾種： ?。?）在更換零件時選擇的型號有誤，接口不是很匹配，在擰緊的時候產(chǎn)生變形而使得管路堵塞?！ 。?）樣品處理液凈化得不干凈，長期會在六通閥和柱之間形成阻塞不暢。 ?。?）在使用手動六通閥時，有些人可能由于手勁小的原因，轉(zhuǎn)動的不到位，于是造成流路形成了死堵，壓力快速升高超過警戒值?！ 。?）在使用金屬管路作出廢液管時，應當注意可以廢液瓶中先放一些水，并把廢液管的出口端放在液面下。如果位于在液相上且實驗使用較高濃度的緩沖鹽溶液，在停機時可能在出口端結晶成塊并造成堵塞。這種情況不常見，但卻的確發(fā)生過。 “堵”的原因講了不少，現(xiàn)介紹查堵的方法?！ ≡诎l(fā)生“堵”的現(xiàn)象后，就需要找出原因，主要是什么位置發(fā)生了“堵”。注意，絕大多數(shù)情況下，整個系統(tǒng)只會有一個地方發(fā)生堵塞?！ 〔槎碌姆椒ㄊ菑奈蚕蚯澳嫦蚍侄尾痖_，仔細觀察壓力數(shù)值，如果某一個部件（柱子除外）裝上和拆下時的壓力差別很大，可發(fā)展變化判斷。至于柱的堵塞，可以通過換同樣規(guī)格的柱的壓力是否一致來判斷。
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