液相色譜儀根據(jù)固定相是液體或是固體，又分為液-液色譜(LLC)及液-固色譜(LSC)。高效液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，下面將針對3大系統(tǒng),敘述其各自的組成與特點(diǎn)。
1．進(jìn)樣系統(tǒng)
液相色譜儀一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作，進(jìn)樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。
2．輸液系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為l．47～4．4X10Pa，流速可調(diào)且穩(wěn)定，當(dāng)高壓流動相通過層析柱時(shí)，可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動速度，這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存器和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、PH值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(zhì)(即使僅有一個(gè)基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體)都能獲得有效分離。
3.分離系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長度為10～50cm(需要兩根連用時(shí)，可在二者之間加一連接管)，內(nèi)徑為2～5mm，由優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，住內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相(由基質(zhì)和固定液構(gòu)成)．固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹脂或硅膠構(gòu)成，它們都有惰性(如硅膠表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔徑可達(dá)1000?)和比表面積大的特點(diǎn)，加之其表面經(jīng)過機(jī)械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣)，或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因(如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等)或配體的有機(jī)化合物。因此，這類固定相對結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素(PSA)后，就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來。另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達(dá)到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)。基質(zhì)粒度小，微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論分析，基質(zhì)粒度小，塔板理論數(shù)N就越大。這也進(jìn)一步證明基質(zhì)粒度小，會提高分辨率的道理。再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60C，通過改善傳質(zhì)速度，縮短分析時(shí)間，就可增加層析柱的效率。
1、氘燈外罩污染：不要用手直接接觸氘燈外罩，手上含有的油脂類物質(zhì)會阻礙氘燈的光源的發(fā)射光，導(dǎo)致讀數(shù)偏低。一旦不小心用手直接接觸到了氘燈，在氘燈安裝之前可用異丙醇對氘燈做清潔工作。
2、氘燈的開關(guān)頻率：頻繁的開關(guān)及過長時(shí)間的開燈等都會對燈的壽命產(chǎn)生影響，一般氘燈點(diǎn)亮后須要30分鐘左右的穩(wěn)定時(shí)間。特別注意的是在氘燈剛剛關(guān)閉時(shí)要等其冷卻之后才能再次開啟。因?yàn)殡疅羧绻谖蠢鋮s狀態(tài)時(shí)被打開，很可能造成燈絲整體結(jié)構(gòu)的燒壞。
3、避免劇烈物理震蕩：如燈是亮著的話，很可能將燈絲弄壞甚至是弄斷。（因?yàn)楫?dāng)氘燈點(diǎn)亮?xí)r其溫度有2700K度，此時(shí)燈絲幾乎是液態(tài)的。）
4、可更換氘燈的信號：
a、燈的外殼邊緣看不見藍(lán)色的光線。（肉眼可見）；
b、石英外套變黑。（燈關(guān)時(shí)進(jìn)行檢查，冷卻并更換）；
c、之前分析方法中從未出現(xiàn)過的非線形現(xiàn)象（光的吸收率不為線形）；
d、在正常設(shè)置情況下基線漂移嚴(yán)重；
e、正常進(jìn)樣時(shí)不出峰。
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