高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成。
儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相,被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相) 內(nèi),由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù);
在兩相中做相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí),經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程,各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別,被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出,通過檢測(cè)器時(shí),樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀,數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。
液相色譜儀系統(tǒng)由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成。儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相,被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相)內(nèi);
由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù),在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí),經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程;
各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別,被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出,通過檢測(cè)器時(shí),樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀。
高效液相色譜法只要求樣品能制成溶液,不受樣品揮發(fā)性的限制,流動(dòng)相可選擇的范圍寬,固定相的種類繁多,因而可以分離熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質(zhì)。
與試樣預(yù)處理技術(shù)相配合,HPLC所達(dá)到的高分辨率和高靈敏度,使分離和同時(shí)測(cè)定性質(zhì)上十分相近的物質(zhì)成為可能,能夠分離復(fù)雜相體中的微量成分。
隨著固定相的發(fā)展,有可能在充分保持生化物質(zhì)活性的條件下完成其分離HPLC成為解決生化分析問題zui有前途的方法。
由于HPLC具有高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復(fù)利用,流出組分易收集等優(yōu)點(diǎn),因而被廣泛應(yīng)用到生物化學(xué)、食品分析、環(huán)境分析、無機(jī)分析等各種領(lǐng)域。
液相色譜儀與結(jié)構(gòu)儀器的聯(lián)用是一個(gè)重要的發(fā)展方向。
液相色譜柱、特別是高效液相色譜柱的填裝,需要有較高的技巧和熟練的技能。因此,有人甚至將“裝柱”看作是“藝術(shù)加技術(shù)”。但是,只要掌握了一些基本的規(guī)律和方法,任何實(shí)驗(yàn)室都可以填裝出具有較高柱性能的色譜柱。當(dāng)然,目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室多是購買商品預(yù)填裝柱來滿足分離、分析之需。但是在一些有特殊需要的情況下,或?yàn)楣?jié)省經(jīng)費(fèi),在實(shí)驗(yàn)室中自行填裝高效液相色譜柱還是可取的。
液相色譜柱填裝程序中應(yīng)該注意的問題:
?、俑邏翰僮鞯陌踩珕栴}。常發(fā)生的問題是柱子與勻漿罐連接不牢,造成加壓時(shí)柱頭被高壓沖下或柱子從勻漿罐上滑脫。此時(shí),輕則填裝失敗,材料損失,重則造成人身傷害事故,一定要加以防范。除每次填裝前均須仔細(xì)確認(rèn)是否連接正確且牢靠外,可以還可加上由法蘭盤和長螺桿組成的預(yù)防脫落裝置,以防萬一。
?、谕ǔ?,先填裝的柱床較后填裝的柱床緊密。因此,當(dāng)使用時(shí)宜以相反的方向?yàn)橐?,即讓近勻漿罐一端作為使用時(shí)流動(dòng)相的出口,而填裝時(shí)的出口端則作為流動(dòng)相的入口。
?、坌轮邮褂们皯?yīng)以甲醇沖洗20-30min, 后,再改用流動(dòng)相平衡。
④新柱子宜選適宜的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)并記錄,以備存查和比較。