HPLC以它定量分析結(jié)果準確、分析周期短、分析范圍廣及分析檢測限低等優(yōu)勢，在食品添加劑、藥物成分分析等多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。本文就液相色譜儀在實際操作時應(yīng)注意的事項及維護做了簡單介紹。
主要部件介紹
輸液系統(tǒng)
輸液系統(tǒng)主要包括在線脫氣裝置、高壓輸液泵、梯度洗脫裝置。在線脫氣裝置主要功能是流動相在進入柱子前排除氣泡。液相色譜柱的填料顆粒小，通過 2~5 mm 的色譜柱受到的流動阻力很大，因此需要通過高壓輸液泵抽取流動相輸送至色譜柱。
高壓泵按輸液性能可分為恒壓、恒流泵。按機械結(jié)構(gòu)可分為：液壓隔膜泵、氣動放大泵、螺旋注射泵和往復(fù)柱塞泵。
進樣器
進樣器是將分析樣品送入色譜柱的裝置，分為手動、自動進樣器兩種。手動進樣器一般配有20~100μL的定量環(huán)。
色譜柱
色譜柱以液體為流動相，以廣義的固相為固定相來進行分析樣品的分離工作。
色譜柱按照分離模式大致可以分為正相色譜柱和反相色譜柱。
檢測器
檢測器是將色譜柱分離出樣品的物理或化學(xué)特性轉(zhuǎn)換為可以測量的電信號，通過色譜圖記錄下來，由色譜圖中的峰形狀判斷分離效果，依據(jù)標物、分析樣色譜圖的出峰時間、峰面積分別對樣品進行定性定量分析。
維護及使用注意事項
1.開關(guān)機操作注意
分析準備工作做好后，依次打開穩(wěn)壓電源、高壓輸液泵、柱溫箱、檢測器，待各部件自檢結(jié)束，打開連接儀器的電腦，啟動工作軟件。分析工作結(jié)束后，關(guān)閉工作軟件，再依次關(guān)閉檢測器、柱溫箱和高壓輸液泵。
2.對流動相的要求
為保證液相色譜儀器的正常使用，所有流動相必須是色譜級的，且經(jīng)過過濾雜質(zhì)、排除氣泡后裝入干凈的流動相貯存瓶中待用。
(1)流動相的物理化學(xué)性能要求
對分析物要有足夠的溶解能力，以利于提高檢驗的靈敏度;流動相的黏度要小，以保證合適的柱降壓;流動相的沸點要低，以利于制備分離時樣品的回收;流動相的 PH 值一般應(yīng)在 2~7.5;使用期限不得超過 2 天，否則產(chǎn)生細菌污染管路。
(2)流動相的過濾
流動相在使用前都必須經(jīng)過濾，以除去雜質(zhì)微粒。同時要定期清洗吸濾頭，以防雜質(zhì)通過其進入流動相。應(yīng)依據(jù)其是否是水溶性選擇水膜或有機膜(0.45 μm 或 0.22 μm)，使用溶劑過濾裝置，通過真空泵抽氣過濾。
(3)流動相的脫氣
流動相必須預(yù)先脫氣，否則易產(chǎn)生氣泡，影響泵的工作。此外，溶解在流動相中的氧能與某些有機溶劑形成有紫外吸收的絡(luò)合物，提高背景吸收，會在梯度洗脫時造成基線漂移或形成鬼峰。常有的脫氣方法有在線真空脫氣法、超聲波脫氣法、抽真空脫氣法三種。
3.色譜柱的維護及使用注意事項
所有分析樣品把pH值調(diào)節(jié)到適合色譜柱的pH值范圍內(nèi)。進樣要避免超負荷，這是保持色譜柱性能持久良好的重要方法之一。手動進樣器進樣的話，進樣時動作要快速準確。分析物成分復(fù)雜時，要在色譜柱前加色譜保護柱以保護色譜柱。每次分析工作開始時，要對色譜柱進行平衡，用含10%流動相中的有機溶劑的水溶液進行排氣和沖洗色譜柱和管路，沖洗30分鐘左右，將色譜柱中的純有機溶劑替換掉，然后再用至少10倍柱體積的流動相平衡色譜柱，直至基線平衡后方可進樣。
每次分析工作結(jié)束后，一定要立即用一定量的水溶液徹底沖洗色譜柱中的緩沖鹽液，再用對被測物洗脫能力強的溶劑來沖洗色譜柱，沖洗時間不能小于1小時，洗脫溶劑的用量至少為柱體積的20倍。若不及時沖洗色譜柱，雜質(zhì)長時間積累在其中，易堵塞色譜柱，降低柱效性能。長期這樣，會加速減少色譜柱使用壽命。色譜柱4天以上不使用，應(yīng)從儀器上取下，用封頭螺帽把兩頭緊緊密封。色譜柱保存時注意不要強烈震動、碰撞。
4.高壓輸液泵的維護及使用注意事項
每次分析工作結(jié)束后，都應(yīng)及時清洗泵。當有緩沖鹽做流動相時，緩沖鹽與有機溶劑互相交換前一定要用5%的甲醇水溶液清洗泵，防止鹽在有機相中結(jié)晶損壞泵中各組件。緩沖鹽溶液的濃度不要過高，要控制在5%以下，否則高濃度的緩沖鹽會磨損密封墊和活塞，降低其使用壽命。長時間使用高濃度的緩沖鹽，必須用10%的異丙醇色譜級溶液清洗泵，從而保護柱塞和密封墊。
輸液泵工作前要設(shè)置工作壓力范圍，正常工作壓力一般不要超過 30 Mpa，否則經(jīng)常高壓會使密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。平時分析工作要養(yǎng)成記錄壓力的好習(xí)慣，這樣如果工作壓力超過平時正常壓力的10%~15%，就應(yīng)及時查找原因。
5.紫外檢測器的維護及使用注意事項
紫外檢測器有一定的使用壽命，所以平時應(yīng)盡量減少氘燈的使用時間，在柱平衡進行一大半之后，在走基線之前，打開檢測器光源;分析結(jié)束后即可關(guān)閉檢測器光源。要保持檢測器四周環(huán)境清潔，實驗室盡量少開窗戶，定期地面進行吸塵工作，防止檢測器工作時由于靜電吸附灰塵顆粒覆蓋在光學(xué)元件上。檢測器池內(nèi)存在氣泡就會產(chǎn)生噪音，噪音會干擾定量分析，所以流動相須充分脫氣后再使用。
應(yīng)定期清洗流通池。如觀察到流通池內(nèi)部無氣泡或臟物，應(yīng)清洗流通池。通過注射器用異丙醇等有機溶劑沖洗池內(nèi)，以清洗透鏡。如是含有緩沖鹽的溶劑作流動相，應(yīng)在使用異丙醇沖洗前用水替換池中原先有的溶劑。
高效液相色譜儀分析樣品的種類繁多、物理形態(tài)廣泛、組成及其濃度復(fù)雜多變，對分析結(jié)果的干擾因素很多，為達到分析目的，樣品要進行有效的制備。高效液相色譜儀分析樣品的制備包括預(yù)處理、提取、凈化和濃縮等過程。 一、預(yù)處理： 1、固體樣品：含水較低，粉碎過篩。含水量較高，取使用部分烘干后，粉碎過篩。 2、液體樣品：攪拌混合均勻。 3、特殊樣品：根據(jù)實驗要求進行特殊處理。 二、提?。?nbsp; 1、浸提法（固-液萃取法）：將樣品浸泡在溶劑中，把固體樣品中的某些組分浸出。 2、萃取法（液-液萃取法）：利用被提取組分在互不相溶的兩種溶劑中分配系數(shù)的不同實現(xiàn)分離。 三、凈化： 1、萃取法：適用于液體樣品，少量多次。 2、化學(xué)法：通過使雜質(zhì)或待測物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而改變其溶解性，使其與原體系分離。 3、層析法：利用混合物中各組分理化性質(zhì)的不同，使各組分在支持物上的移動速度不同，而將各組分分離。 四、濃縮： 1、常壓濃縮：通過升高溫度，將溶劑由液態(tài)轉(zhuǎn)化成氣態(tài)被抽走，從而達到濃縮目的。適用于揮發(fā)性和沸點相對較低的樣品。 2、減壓濃縮：通過抽真空，使容器內(nèi)產(chǎn)生負壓，在不改變樣品化學(xué)性質(zhì)的前提下降低樣品的沸點，使一些高溫下化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定或沸點高的溶劑在低溫下由液態(tài)轉(zhuǎn)化成氣態(tài)被抽走，從而達到濃縮目的。 3、冷凍干燥：冷凍的同時抽真空減壓，使溶劑升華。適用于生物活性樣品。 4、氮吹儀濃縮：采用氮氣對加熱樣品進行吹掃，使樣品迅速濃縮，達到快速分離純化的效果。適用于農(nóng)殘檢測和制藥行業(yè)等樣品的批量處理。
液相色譜儀結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且不同型號的色譜儀，出故障時產(chǎn)生的現(xiàn)象有可能不同，以下幾項液相色譜儀常見故障排除方法僅供參考：
1、檢測器開機時屏幕顯示不正常，出現(xiàn)缺字、坐標圖形異樣、光標無法移動等象
原因：工作電源不正常或儀器附件有強干擾源存在；
排除方法：檢查工作電源電壓，采取穩(wěn)壓措施；關(guān)機后重新開機；檢測器微機系統(tǒng)故障；
2、柱前壓力逐漸升高
原因：
（1）流動相中存在大顆粒的物質(zhì)；
（2）樣品未經(jīng)過過濾處理；
（3）柱子輸入端濾片，污染；
對應(yīng)排除方法：
?。?）流動相經(jīng)＜5μ的真空抽濾瓶過濾后再使用；
（2）樣品須經(jīng)濾膜過濾；
（3）拆下柱的濾片用超聲波清洗,同時刮去柱口表面被污染的固定相；
3、輸液泵壓力指示為零(或＜0.5MPa)且柱后無液體流出
原因：
?。?）柱前導(dǎo)管接頭漏液；
?。?）泵柱室內(nèi)有大量氣泡存在；
?。?）貯液瓶內(nèi)試劑用完；
?。?）輸液泵未工作；
對應(yīng)排除方法：
?。?）檢查各接口是否有漏液；
（2）放開泵出口接頭；用“清洗”鍵沖洗泵體；
（3）添加流動相；
（4）按輸液泵操作方法，檢查其工作狀態(tài)；
4、組分峰極小或不出峰
原因：
（1）波長選擇不正確；
?。?）檢測器輸出衰減太大；
?。?）進樣口漏液；
（4）進樣閥樣品廢液管堵塞，樣品未進入定量管；
（5）進樣后未按啟動鍵；
（6）定量管容積過小；
?。?）樣品濃度過??；
?。?）檢測器燈源老化或失效；
?。?）流動相不純；
對應(yīng)排除方法：
（1）按標準重新選擇波長；
?。?）重新選擇輸出量程范圍；
?。?）修理進樣閥；
?。?）拆下六通閥上廢液管(5#,6#)重新安裝；
?。?）進樣后立即按啟動鍵；
?。?）更換大容量定量管；
?。?）濃縮樣品后再進樣；
?。?）更換燈源；
?。?）選擇高純度的流動相；
5、輸液泵壓力指示超過規(guī)定的范圍，且柱后無液體流出
原因：
?。?）分離柱阻力過大(陳舊柱子)；
?。?）柱前導(dǎo)管堵塞；
?。?）泵柱塞內(nèi)有少量氣泡存在；
?。?）柱子進口處過濾膜堵塞；
?。?）進樣閥手柄未旋到底(處于中間狀態(tài))；
?。?）導(dǎo)管中有顆粒狀固體堵塞；
對應(yīng)排除方法：
（1）更換柱子；
?。?）從柱后開始逐級向上拆開接頭檢查；
?。?）拆開泵接頭，用“清洗”檔趕盡氣泡。；
?。?）拆開柱前接頭、更換或清洗過濾膜；
?。?）左右旋動六通閥至極限位置；
?。?）逐級檢查，并更換導(dǎo)管；
6、基線大幅度波動(即紫外檢測器的輸出電平值極不穩(wěn)定)
原因：流通池內(nèi)留有大量的氣泡；流通池漏液；紫外檢測器有故障
對應(yīng)排除方法：排除氣泡；檢修流通池；停止恒流泵工作，檢查紫外檢測器
7、溫度指示波動＞±1℃
原因：
?。?）設(shè)置溫度值過低；
?。?）柱箱密封蓋未蓋好；
?。?）溫度控制器未啟動；
?。?）柱箱升過高溫后，再設(shè)置低溫；
（5）溫控部件有故障；
?。?）控溫鉑電阻接觸不良；
對應(yīng)排除方法：
?。?）設(shè)置最低溫度應(yīng)室溫以上10℃；
（2）檢查柱安裝過程；
?。?）按起始鍵(指示燈亮)；
?。?）開機后會逐漸穩(wěn)定(正常現(xiàn)象)；
?。?）修理溫度控制器；
（6）擰緊固定鉑電阻引線的螺釘；
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