一、液相色譜儀峰分叉怎么回事?
造成這種情況的原因一般是色譜柱被污染，或柱頭填料塌陷導(dǎo)致的。
對(duì)于*種情況，先用純水反向沖洗柱子，然后換成甲醇沖洗，接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時(shí)間的長(zhǎng)短由樣品污染的情況而定)，再換成甲醇沖洗，然后用純水沖洗，zui后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。如沖洗后依然出峰不佳，則考慮第二種情況。
對(duì)于第二種情況，擰開(kāi)柱頭，檢查柱填料是否硬結(jié)或塌陷。去除硬結(jié)部分(污染的填料)，裝入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用與柱內(nèi)徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊，再填平，滴甲醇，再壓緊反復(fù)幾次，直至裝滿填平。柱頭用甲醇沖洗干凈，擦凈柱外壁的填料，擰緊柱頭，用純甲醇沖洗30分鐘以上。
二、如何排除液相色譜儀氣泡溢出的故障?
流動(dòng)相內(nèi)產(chǎn)生都無(wú)法清除不斷產(chǎn)生的氣泡，主要是因?yàn)檫^(guò)濾器長(zhǎng)期沉浸于乙酸銨等緩沖液內(nèi)，過(guò)濾器內(nèi)部由于霉菌的生長(zhǎng)繁殖，形成菌團(tuán)，阻塞了過(guò)濾器，緩沖液難以流暢地通過(guò)過(guò)濾器，空氣在泵的壓力作用下經(jīng)過(guò)濾器進(jìn)入流動(dòng)相。
過(guò)濾器浸泡于5%硝酸溶液中，超聲清洗幾分鐘即可;亦可將過(guò)濾器浸泡于5%硝酸溶液中12～36小時(shí)，輕輕震蕩幾次，再將過(guò)濾器用純水清洗幾次，打開(kāi)泄壓閥，打開(kāi)purge鍵清洗脫氣，如仍有氣泡不斷從過(guò)濾器冒出，繼續(xù)將過(guò)濾器浸泡于5%硝酸溶液中，如沒(méi)有氣泡不斷從過(guò)濾器中冒出，說(shuō)明過(guò)濾器內(nèi)部的霉菌菌團(tuán)已被硝酸破壞，流動(dòng)相可以流暢地通過(guò)過(guò)濾器。打開(kāi)泄壓閥，打開(kāi)泵，流速調(diào)至1.0～3.0ml/min，純水沖洗過(guò)濾器1小時(shí)左右。即可將過(guò)濾器清洗干凈。關(guān)閉泄壓閥，純甲醇沖洗半小時(shí)即可。
三、自檢時(shí)，為什么有時(shí)會(huì)出現(xiàn)“鎢燈能量低”的錯(cuò)誤?
一般來(lái)說(shuō)，原因是系統(tǒng)中有擋光物，光路偏離，鎢燈電源系統(tǒng)或鎢燈燈泡已壞。這時(shí)首先要檢查光度室是否有擋光物;打開(kāi)檢測(cè)器光源室蓋，檢查氘燈是否點(diǎn)亮;如果氘燈不亮，則關(guān)機(jī)，更換新氘燈，換時(shí)，需注意型號(hào);檢查氘燈保險(xiǎn)絲，看是否松動(dòng)、氧化、燒斷;如果故障，應(yīng)立即更換;再開(kāi)機(jī)重新自檢;若仍出現(xiàn)上述故障，則重新安裝軟件后再進(jìn)行自檢。
四、出現(xiàn)壓力波動(dòng)大，流量不穩(wěn)定該怎么辦?
造成這種情況的原因是系統(tǒng)中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物，使得兩者不能密封。處理工作中注意觀察流動(dòng)相的量，保證不銹鋼濾器沉入儲(chǔ)液器瓶底，避免吸入空氣，流動(dòng)相要充分脫氣。如為單向閥和閥座之間夾有異物，拆下單向閥，放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗。
五、液相色譜儀峰面積重復(fù)性不好怎么回事?
主要原因可能有進(jìn)樣閥漏液、加樣針不到位或液量不足。針對(duì)*種情況，處理時(shí)應(yīng)對(duì)更換進(jìn)樣閥墊圈;對(duì)于第二種情況保證加樣針插到底，注射樣品溶液后須快速、平穩(wěn)地從LOAD狀態(tài)轉(zhuǎn)換到INJECT狀態(tài)，以保證進(jìn)樣量的準(zhǔn)確。日常工作中，液相色譜儀的保養(yǎng)非常重要，如要注意不要讓空氣進(jìn)入輸液系統(tǒng)和高壓泵中，儲(chǔ)液器內(nèi)的溶液如長(zhǎng)時(shí)間未用應(yīng)清洗儲(chǔ)液器并更換溶液，每次用完色譜儀后緩沖液要用純水沖洗干凈，防止無(wú)機(jī)鹽析出或沉積;樣品的前處理也很重要，任何樣品都要盡可能地去除雜質(zhì)，完全溶解，盡量減少對(duì)色譜柱的污染，以延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，同時(shí)避免注射過(guò)濃的樣品溶液，以免殘留液在進(jìn)樣閥內(nèi)析出固體引起堵塞;色譜柱作好標(biāo)記，用于不同分析目的的色譜柱不要混用等。
六、液相色譜柱壓升高的原因是什么?
造成柱壓升高的原因很多。一般是由于柱床內(nèi)產(chǎn)生了異常的占位性物體，造成流體阻力加大所引起的。例如，緩沖液鹽分如(乙酸銨等)沉積于柱內(nèi)，或樣品污染沉積。針對(duì)*種情況，處理時(shí)應(yīng)先用40～50℃的純水，低速正向沖洗柱子，待柱壓逐漸下降后，相應(yīng)提高流速?zèng)_洗，柱壓大幅度下降后，用常溫純水沖洗，之后用純甲醇沖洗柱子30分鐘;對(duì)于第二種情況，由樣品的沉積引起污染的C18柱，和純水反向沖洗柱子，然后換成甲醇沖洗，接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時(shí)間的長(zhǎng)短由樣品污染的情況而定)，再用換成甲醇沖洗，然后用純水沖洗，zui后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。
早期使用隔膜和停流進(jìn)樣器，裝在色譜柱進(jìn)口處?，F(xiàn)在大都使用六通進(jìn)樣閥或自動(dòng)進(jìn)樣器。
進(jìn)樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)對(duì)色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。HPLC進(jìn)樣方式可分為：隔膜進(jìn)樣、停流進(jìn)樣、閥進(jìn)樣、自動(dòng)進(jìn)樣。
1.隔膜進(jìn)樣。
用微量注射器將樣品注進(jìn)專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的與色譜柱相連的進(jìn)樣頭內(nèi)，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎即是零，可以獲得較佳的柱效，且價(jià)格便宜，操縱方便。但不能在高壓下使用(如10MPa以上);此外隔膜輕易吸附樣品產(chǎn)生記憶效應(yīng)，使進(jìn)樣重復(fù)性只能達(dá)到1~2%;加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規(guī)分析使用受到限制。
2.停流進(jìn)樣。
可避免在高壓下進(jìn)樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動(dòng)時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)“鬼峰”;另一缺點(diǎn)是保存時(shí)間不準(zhǔn)。在以峰的始末信號(hào)控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。
3.閥進(jìn)樣。
一般HPLC分析常用六通進(jìn)樣閥(以美國(guó)Rheodyne公司的7725和7725i型常見(jiàn))，其關(guān)鍵部件由圓形密封墊(轉(zhuǎn)子)和固定底座(定子)組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進(jìn)樣(約下降5~10%左右)，但耐高壓(35~40MPa)，進(jìn)樣量正確，重復(fù)性好(0.5%)，操縱方便。
4.自動(dòng)進(jìn)樣。
用于大量樣品的常規(guī)分析。
流動(dòng)相相當(dāng)于液相的血液，可以想象對(duì)液相的重要程度。那么流動(dòng)相都需要注意什么呢? 01、過(guò)濾溶劑 溶劑在使用前一定要用0.5μm的過(guò)濾器過(guò)濾，如果使用固體化學(xué)試劑(緩沖鹽)配制流動(dòng)相，過(guò)濾特別重要，不能讓固體微粒污染泵，阻塞進(jìn)樣器和柱頭過(guò)濾片。本實(shí)驗(yàn)室有水溶性和脂溶性?xún)煞N過(guò)濾膜供選擇(反光面朝上)，過(guò)濾水溶性流動(dòng)相時(shí)(如甲醇/水)，先用1～2mL甲醇潤(rùn)濕過(guò)濾膜，有助于快速抽濾?！ ?2、保持儲(chǔ)液瓶的清潔 用普通溶劑瓶作流動(dòng)相儲(chǔ)液器應(yīng)不定期廢棄瓶子，最后一次應(yīng)用HPLC級(jí)的水或溶劑清洗，不能在清洗過(guò)程中留下污跡。 03、保證溶劑的質(zhì)量 一定要用HPLC級(jí)的溶劑，水也應(yīng)達(dá)到HPLC級(jí)，同樣也要使用高純度的緩沖鹽。 一些因流動(dòng)相引起的常見(jiàn)問(wèn)題 01、流動(dòng)相脫氣不充分 流動(dòng)相受熱，或者流動(dòng)相不同組分混合時(shí)會(huì)有氣體產(chǎn)生，氣泡進(jìn)入泵內(nèi)引起壓力波動(dòng)，增加噪音，色譜圖上出現(xiàn)毛刺。可試用下列方法解決問(wèn)題：流動(dòng)相再脫氣;采用更有效的脫氣方法或兩種方法配合使用;改系統(tǒng)內(nèi)混合為系統(tǒng)外預(yù)混合。 02、流動(dòng)相供給不暢 流動(dòng)相用完，管道中吸入氣體引起泵壓力不穩(wěn)。應(yīng)經(jīng)常觀察儲(chǔ)液器中流動(dòng)相的量，加足流動(dòng)相保證所有的樣品分析完畢。輸液管道上裝沉子沉至瓶底，儲(chǔ)液器蓋上留一小孔正好夾住進(jìn)液管，使其不能上下移動(dòng)?！ ∵^(guò)濾器阻塞引起管道和泵腔空化，壓力不穩(wěn)。過(guò)濾器被微粒所阻塞或長(zhǎng)霉，去掉過(guò)濾器后如果系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)正常，說(shuō)明已找出問(wèn)題，換上新的過(guò)濾器則可。有時(shí)候換上新的過(guò)濾器仍然不暢，那就需要查查流動(dòng)相的制備過(guò)程，或者換大孔徑的過(guò)濾器。不管如何，流動(dòng)相都需要重新過(guò)濾?！ ×魉龠^(guò)高、阻力大，造成空化現(xiàn)象，這是由于過(guò)濾器孔徑、管道內(nèi)徑、流速和溶劑黏度等引起的。如果流速大于10mL/min，常會(huì)出現(xiàn)這種現(xiàn)象?！ ∈褂孟铝蟹椒ń鉀Q： (1)使用低流速; (2)換大孔徑的過(guò)濾器; (3)增加進(jìn)液管道內(nèi)徑; (4)抬高或加壓儲(chǔ)液器; (5)不用過(guò)濾器，但流動(dòng)相一定要先過(guò)濾; (6)儲(chǔ)液器蓋子太緊，在儲(chǔ)液器內(nèi)形成真空，打出的流動(dòng)相不連續(xù)。應(yīng)松開(kāi)蓋子或留有1mm的縫隙; (7)進(jìn)液管道阻塞或彎曲使泵抽不到液，注意調(diào)整進(jìn)液管道或更換新的。其它問(wèn)題包括滲漏或接頭松動(dòng)、泵部件損壞等，都能引起供液不正常。 03、流動(dòng)相和儲(chǔ)液器被污染 由于污染，噪音越來(lái)越大，檢測(cè)器基線上升。污染物可能被泵以穩(wěn)定的濃度打入系統(tǒng)，而再以穩(wěn)定的濃度流出來(lái)，所以在色譜圖中不出多余的峰。用梯度洗脫時(shí)弱流動(dòng)相可以使污染物聚在柱頂，流動(dòng)相強(qiáng)度增加后污染物可能被洗脫出來(lái)一個(gè)大的偽峰。有時(shí)基線噪音突然增大或突然提高，都是因?yàn)榉磸?fù)加進(jìn)新的流動(dòng)相或系統(tǒng)用得太久(通宵)所造成的。新加進(jìn)的流動(dòng)相有污染物或者流動(dòng)相長(zhǎng)霉，繁殖了細(xì)菌?！ ∨K的儲(chǔ)液器會(huì)污染清潔的流動(dòng)相。每種流動(dòng)相備有專(zhuān)用的儲(chǔ)液器，或者定期報(bào)廢儲(chǔ)液器?！ ×鲃?dòng)相污染來(lái)自這幾個(gè)方面 04、試劑質(zhì)量不高，玻璃器皿不合格; 微生物的影響; 配制流動(dòng)相時(shí)操作不當(dāng)?shù)? 因此要求高純度化學(xué)試劑和HPLC級(jí)溶劑; 玻璃器皿按規(guī)定清洗干凈; 為防止微生物生長(zhǎng)，每天要用甲醇清洗系統(tǒng); 懷疑系統(tǒng)內(nèi)生長(zhǎng)了微生物，可用稀硝酸沖洗即可(注意不要損壞柱和管道系統(tǒng)); 真空脫氣時(shí)防止泵油帶入流動(dòng)相; 用清潔的惰性塞子、攪棒、過(guò)濾器和玻璃器皿配制流動(dòng)相; 已經(jīng)污染的流動(dòng)相一定要廢棄掉。
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