1.對于一根常用的C18柱，拿到一根新柱的時(shí)候應(yīng)該怎樣進(jìn)行活化及維護(hù)?為什么要這樣做?　　答：新柱活化，實(shí)際上是一個(gè)平衡的過程，除了用流動相平衡外，有時(shí)候還必須用所測樣品對新柱進(jìn)行平衡，特別是測定分子量比較高的多肽，尤其重要。因?yàn)榉肿恿扛叩奈镔|(zhì)分子，擴(kuò)散速度慢，平衡所需時(shí)間也相應(yīng)較長。具體平衡方式也很簡單，多進(jìn)幾次樣品，直到峰面積和保留時(shí)間穩(wěn)定，再進(jìn)行正式進(jìn)樣測定?！　∪绻涌炱胶鈺r(shí)間，把前面用來平衡的進(jìn)樣樣品濃度加大，或者不等洗脫完成，連續(xù)進(jìn)樣多針。用待測物對新柱平衡，目的是將硅膠基質(zhì)填料表面具有非特異性吸附的位點(diǎn)的吸附能力飽和掉。　　2.測定多肽，一般采用什么柱子?流動相是乙腈和水，還有微量的TFA。特別是像類似三肽的短肽，應(yīng)該怎么選擇柱子?　　答：分子量不高的多肽一般選用常規(guī)C18柱就能測定，也有用離子交換柱、水性C18柱和Hilic親水作用柱的?！　?.氨基柱在進(jìn)酸性樣品時(shí)，很傷柱子，如使用一段時(shí)間后，柱效降低，峰形改變，如何恢復(fù)?　　答：氨基柱測酸性樣品，應(yīng)該是用氨基柱的HILIC模式。酸的存在可能會使略帶負(fù)電荷的氨基官能團(tuán)質(zhì)子化，導(dǎo)致使用一段時(shí)間后對于某些類的分析物保留性質(zhì)有所改變或表現(xiàn)在柱效下降。　　建議：用5-10倍的柱體積的含0.5-1.0%NH3的乙腈-水(50:50)溶液沖洗該柱(沖洗后當(dāng)然要再用不含堿的流動相洗去多余氨)，之后再進(jìn)行分析這類酸性分析物時(shí)建議在流動相中略微添加少許氨如0.1%。　　4.色譜柱的技術(shù)都有哪些?比如封尾等，這些技術(shù)在應(yīng)用時(shí)都體現(xiàn)在哪里?　　答：色譜柱技術(shù)包括填料技術(shù)和裝柱技術(shù)，填料技術(shù)自不待言，填料的好壞對色譜柱分離性能和選擇性有決定性影響。裝柱技術(shù)也沒有想象中的這么簡單，不同固定相、不同粒徑、不同柱管內(nèi)徑和長度，裝柱工藝都有所不同，要裝出緊密、穩(wěn)定、均一的柱床，更多是一門藝術(shù)，需要經(jīng)驗(yàn)積累?！　鴥?nèi)和國外相比，我認(rèn)為色譜柱的差距在于：國內(nèi)公司以前都不會自己開發(fā)填料，一般買國外現(xiàn)成填料裝柱，買到的填料質(zhì)量控制權(quán)不在自己手里。另外因?yàn)檠b柱歷史短，經(jīng)驗(yàn)積累少，裝柱工藝也沒有完全達(dá)到國外水平。另外，對色譜柱性能很關(guān)鍵的基礎(chǔ)材料-----裸硅膠，國產(chǎn)的還不過關(guān)，在純度、粒徑和孔徑的均一性方面和國外產(chǎn)品相比，差距很大?！　?.色譜柱技術(shù)的差距在哪里?　　答：液相色譜柱裝填實(shí)際上是有一定技巧和程序，可能還有一些運(yùn)氣。一般使用高壓勻漿方法裝填。也就是能讓填料在溶劑內(nèi)均勻地懸浮。然后用瞬間高壓壓實(shí)，這實(shí)際上用到了不同比例的勻漿液體，和合適的壓力。壓力太大，顆粒破碎，壓力太小，塔板數(shù)少。同時(shí)壓力需要穩(wěn)定，不然分布不均，拖尾嚴(yán)重。同時(shí)還有頭上平整程度。套上套，就可以用了。　　6.柱子在什么情況下可以清洗一下篩板呢?原來也討論過這個(gè)問題，我也拆下來清洗過，但我看到柱前段的污染更甚，于是就用刀片刮了刮，然后把清洗好的篩板安裝上去。問題解決了，但使用壽命會不會減少呢?　　答：柱頭污染了，就取出污染的，再裝一些填料。因?yàn)榧尤肽愎瘟诵┨盍?，那么微觀的塔板數(shù)就少了。假入你刮得不多，僅表面，可能就是一些臟物，所以，問題解決。但是今后還會有同樣問題，再掛，那么不小心刮，影響柱效。建議還是裝一個(gè)預(yù)柱。　　7.如果柱子取下來放置一段時(shí)間，需要做什么保護(hù)嗎?　　答：對一般的反相柱，也就是洗干凈后放到純甲醇(乙腈)或者是80%左右的甲醇(乙腈)水中，然后用堵頭塞緊柱兩頭，以免保存溶劑揮發(fā)，應(yīng)該不需要做特殊的保護(hù)?！　?.流動相中加入適量的四氫呋喃可以改善峰形的機(jī)理是什么?　　答：《高效液相色譜方法及應(yīng)用》于世林編著的上面說：甲醇為質(zhì)子給予體、乙腈為質(zhì)子接受體、四氫呋喃是偶極溶劑，應(yīng)該除了極性影響，還有另外的影響因素，至于分離機(jī)理，還是比較復(fù)雜的，不能看成是個(gè)萬能方法?！　?.關(guān)于色譜柱的填裝問題!我個(gè)人認(rèn)為現(xiàn)在色譜柱的填裝一般有3種情況：　　(1)國外生產(chǎn)填料并填裝完成成品賣到國內(nèi);　　(2)國外生產(chǎn)填料，國內(nèi)填裝銷售;　　(3)國內(nèi)生產(chǎn)填料，國內(nèi)填裝銷售?！　∫话闱闆r下，第1種情況賣的比較貴，也質(zhì)量可以!可是我就不明白了：如果是填料的生產(chǎn)很復(fù)雜的話，那么填裝上國內(nèi)也跟不上去嗎?為什么換在國內(nèi)填裝就會出現(xiàn)或多或少的一些小問題呢?　　答：國內(nèi)填裝會出現(xiàn)質(zhì)量小問題，和國內(nèi)目前普遍做事沒有國外嚴(yán)謹(jǐn)有關(guān)吧。如果工藝技術(shù)上沒有問題，又能制訂并切實(shí)執(zhí)行一整套嚴(yán)格的生產(chǎn)質(zhì)量管理措施，國內(nèi)填裝和國外填裝并無區(qū)別?！　?0.國產(chǎn)色譜柱在市場上占有比例如何啊?　　答：國內(nèi)色譜柱市場還沒有人進(jìn)行過科學(xué)統(tǒng)計(jì)，連一年色譜柱銷售總量也眾說紛云，更別說國內(nèi)生產(chǎn)色譜柱所占份額了。我估計(jì)是占30%左右吧?！　?1.預(yù)柱或保護(hù)柱用還是不用的問題!原來分析中藥品種時(shí)，我一直都是用保護(hù)柱。但來到新公司后，發(fā)現(xiàn)大家都沒有使用，幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室連保護(hù)柱都沒找到一個(gè)，也就是說大家從來都沒有用過。后來問一個(gè)老員工，說是有可能影響藥品分析。我就想問：安裝保護(hù)柱后會影響樣品分析嗎?我們做的大多是頭孢類的抗生素?！　〈穑簯?yīng)該這樣說，加上保護(hù)柱，肯定有利于保護(hù)色譜柱不受一些顆粒物質(zhì)的堵塞，肯定有害于分離度和柱效，因?yàn)楸Ｗo(hù)柱中間有著死體積的存在。但是如果保護(hù)柱接得好，并且盡量控制其匹配性和經(jīng)常更換，分離度和柱效應(yīng)該影響并不大?！　☆^孢類的抗生素也要看到底是原料藥還是制劑嘍，有些原料藥，可以根據(jù)色譜柱的損耗選擇添加預(yù)柱(中間是個(gè)篩板)，制劑的話，如果有輔料嚴(yán)重干擾或者流動相鹽分比較大，那還是可以配個(gè)保護(hù)柱?！　?2.用的是四元梯度泵A50%甲醇B50%水經(jīng)常出現(xiàn)?；蜻M(jìn)氣泡這是什么原因?　　答：水/甲醇比例在55：45時(shí)，黏度和柱壓有個(gè)極大值。50：50接近了這個(gè)極值，柱壓是比較高的，但影響柱壓最大的還是填料粒徑和色譜柱內(nèi)徑，你這個(gè)實(shí)例中不知用的什么規(guī)格的色譜柱?系統(tǒng)壓力高，可能會因溶劑泵中的過濾頭供液速度跟不上而導(dǎo)致氣泡進(jìn)入系統(tǒng)，停機(jī)也應(yīng)該是因?yàn)闅馀葸M(jìn)入壓力下降的原因，可考慮更換液體通量更大的過濾頭?！　?3.柱填充的技術(shù)性很強(qiáng)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱。為什么以20um為分界點(diǎn)?填料方法的前三種都是濕法嗎，能不能對四種填充方法做一個(gè)簡短的說明?　　答：資料顯示：在正常條件下，填料粒度>20?m時(shí)，干法填充制備柱較為合適;顆粒<20?m時(shí)，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種　?、俑邏簞驖{法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充;　?、趶较蚣訅悍ǎ琖aters專利;　?、圯S向加壓法，主要用于裝填大直徑柱;　?、芨煞??！　?4.想請您具體說明一下反沖色譜柱的方法，是不連檢測器嗎?　　答：反沖就是將柱子反向連到系統(tǒng)中。因?yàn)橛形廴疚锓礇_出來，當(dāng)然不連檢測器，出液端直接接到廢液瓶就可以?！　?5.網(wǎng)上對柱子是否可以反沖一直有爭論，那什么樣的柱子可以反沖，什么不可以。反沖后是正者用，還是反著用。具體到各型號柱子不僅是ODS柱，其他如正向柱、氨基柱、離子交換柱等可以都有解釋?！　〈穑阂话愕恼喾聪嘀鶓?yīng)該都能反沖，只有兩端篩板孔徑不對稱的柱子不能反沖，不過目前這樣的柱子已經(jīng)比較少見了。反沖是為了把柱頭的污染物沖洗掉，反沖后還是正著用比較好，以免柱子的兩頭都被污染。我們一直提倡的是：正向使用，反向沖洗?！　?6.我在做方法開發(fā)的時(shí)候,用乙腈和水作為流動相,在調(diào)整梯度的時(shí)候發(fā)現(xiàn),剛開始用60%乙腈,RT為2.5分鐘,調(diào)到40%乙腈,RT沒有變化,30%也沒有變化,一直調(diào)到20%的時(shí)候,RT突然變到了約13分鐘,請問這是什么原因?我用的是離子交換柱。　　答：離子交換柱的保留時(shí)間主要由洗脫液的離子強(qiáng)度和pH決定，你現(xiàn)在講的比較簡單，需要把你的方法說的詳細(xì)一點(diǎn)才能做具體的分析。譬如分析物是什么情況，其含有極性電離基團(tuán)和非極性基團(tuán)是什么性質(zhì)?離子交換柱是聚合物基質(zhì)還是硅膠基質(zhì)?水相是什么緩沖鹽?