詳述Pcr儀的四大分類及常見問題解答
PCR就是利用DNA聚合酶對特定基因做體外或試管內(nèi)In Vitro的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶進行專一性的連鎖復制。目前常用的技術，可以將一段基因復制為原來的一百億至一千億倍。根據(jù)DNA擴增的目的和檢測的標準，可以將PCR儀分為普通PCR儀，梯度PCR儀，原位PCR儀，實時熒光定量PCR儀四類。
普通PCR儀
一般把一次PCR擴增只能運行一個特定退火溫度的PCR儀，稱之為普通PCR儀。如果要用它做不同的退火溫度則需要多次運行。主要是用作簡單的，對目的基因退火溫度的擴增。
主要應用于科研、教學、臨床醫(yī)學、檢驗、檢疫等。
梯度PCR儀
一次性PCR擴增可以設置一系列不同的退火溫度條件（通常12種溫度梯度）的稱之為梯度PCR儀。因為被擴增的不同的DNA片段其zui適合的退火溫度不同，通過設置一系列的梯度退火溫度進行擴增，從而一次性PCR擴增就可以篩選出表達量高的zui適合退火溫度進行有效的擴增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴增，這樣既節(jié)約時間，也節(jié)約經(jīng)費。在不設置梯度的情況下亦可當做普通的PCR用。正真的梯度，是每一排管都有的加熱控溫探頭，2009年為止只有美國ABI公司可以做到。其他的都是從兩頭的熱傳遞來設計控溫。
梯度PCR儀多應用于科研、教學機構(gòu)。
原位PCR儀
（有些品牌的PCR儀具有普通PCR、梯度PCR、原位PCR的功能，通過替換模塊進行多用途開展實驗工作）
是用于從細胞內(nèi)靶DNA的定位分析的細胞內(nèi)基因擴增儀。如病原基因在細胞的位置或目的基因在細胞內(nèi)的作用位置等?？杀３旨毎蚪M織的完整性，使PCR反應體系滲透到組織和細胞中，在細胞的靶DNA所在的位置進行基因擴增。不但可以檢測到靶DNA，還能標出靶序列在細胞內(nèi)的位置。于分子和細胞水平上研究疾病的發(fā)病機理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)變有著重大的實用價值。
實時熒光定量PCR儀
在普通PCR儀設計基礎上增加熒光信號激發(fā)和采集系統(tǒng)和計算機分析處理系統(tǒng)，形成了具有熒光定量PCR功能的儀器。其PCR擴增原理和普通PCR擴增原理相同，在PCR擴增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進行標記，使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合擴增。擴增的結(jié)果通過熒光信號采集系統(tǒng)實時采集信號連接輸送到計算機分析處理系統(tǒng)，得出量化的實時結(jié)果輸出。
熒光定量PCR儀有單通道，雙通道和多通道之分。當只用一種熒光探針標記的時候，選用單通道；有多種熒光標記的時候使用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標記和目的基因表達產(chǎn)物，因為一次只能檢測一種目的基因的擴增量，需多次擴增才能檢測完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR，實現(xiàn)一次檢測多種目的基因的功能。
實時熒光定量PCR儀主要應用于臨床醫(yī)學檢測、生物醫(yī)藥研發(fā)、食品行業(yè)、科研院校等。
PCR儀常見問題及回答
1. cDNA產(chǎn)量的很低
可能的原因：
*RNA模板質(zhì)量低
*對mRNA濃度估計過高
*反應體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足
*同位素磷32過期
*反應體積過大，不應*過50μl
2. 擴增產(chǎn)物在電泳分析時沒有條帶或條帶很淺
*zui常見的原因在于您的反應體系是PCR的反應體系而不是RT-PCR的反應體系
*與反應起始時RNA的總量及純度有關
*建議在試驗中加入對照RNA
**鏈的反應產(chǎn)物在進行PCR擴增時，在總的反應體系中的含量不要*過1/10
*建議用Oligo(dT)或隨機引物代替基因特異性引物（GSP）用于*鏈合成。由于RNA模板存在二級結(jié)構(gòu)，如環(huán)狀結(jié)果，有可能導致GSP無法與模板退火；或SSⅡ反轉(zhuǎn)錄酶無法從此引物進行有效延伸。
*目的mRNA中含有強的轉(zhuǎn)錄中止位點，可以試用以下方法解決：
a. 將*鏈的反應溫度提高至50℃。
b. 使用隨機六聚體代替Oligo(dT)進行*鏈反應。
3. 產(chǎn)生非特異性條帶
*用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的PCR結(jié)果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。
*在PCR反應中，非特異的起始擴增將導致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。
*由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。
電泳技術是分子生物學研究不可缺少的重要分析手段。電泳分為自由界面電泳和區(qū)帶電泳兩大類：
1、自由界面電泳不需支持物，如等電聚焦電泳、等速電泳、密度梯度電泳及顯微電泳等，這類電泳目前已很少使用。
2、區(qū)帶電泳則需用各種類型的物質(zhì)作為支持物，常用的支持物有濾紙、醋酸纖維薄膜、非凝膠性支持物、凝膠性支持物及硅膠-G薄層等，分子生物學領域中常用的是瓊脂糖凝膠電泳。
下面簡單介紹其使用方法：
1．首先用導線將電泳槽的兩個電極與電泳儀的直流輸出端聯(lián)接，注意極性不要接反。
2．電泳儀電源開關調(diào)至關的位置，電壓旋鈕轉(zhuǎn)到最小，根據(jù)工作需要選擇穩(wěn)壓穩(wěn)流方式及電壓電流范圍。
3．接通電源，緩緩旋轉(zhuǎn)電壓調(diào)節(jié)鈕直到達到的所需電壓為止，設定電泳終止時間，此時電泳即開始進行。
4．工作完畢后，應將各旋鈕、開關旋至零位或關閉狀態(tài)，并撥出電泳插頭。
常用的電泳分析方法主要有：
醋酸纖維素薄膜電泳、凝膠電泳、等電聚焦電泳、雙向電泳、毛細管電泳
電泳儀使用方法
1、首先用導線將電泳槽的兩個電極與電泳儀的直流輸出端聯(lián)接，注意極性不要接反。
2、電泳儀電源開關調(diào)至關的位置，電壓旋鈕轉(zhuǎn)到最小，根據(jù)工作需要選擇穩(wěn)壓穩(wěn)流方式及電壓電流范圍。
3、接通電源，緩緩旋轉(zhuǎn)電壓調(diào)節(jié)旋鈕直到達到的所需電壓為止，設定電泳終止時間，此時電泳即開始進行。
4、工作完畢后，應將各旋鈕、開關旋至零位或關閉狀態(tài)，并撥出電泳插頭。
電泳儀分類
根據(jù)電泳儀原理、電泳儀功能、電泳儀的使用方法、電泳儀的用途不同可以為：
瓊脂糖凝膠電泳、毛細管電泳、凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、醋酸纖維薄膜電泳、高效毛細管電泳、瓊脂糖電泳、SDS-PAGE凝膠電泳、蛋白質(zhì)電泳、血清蛋白電泳、dna電泳、血紅蛋白電泳、蛋白質(zhì)雙向電泳、免疫電泳、等電聚焦電泳、單細胞凝膠電泳、蛋白質(zhì)凝膠電泳、質(zhì)粒電泳、對流免疫電泳、變性電泳等。
PCR的工作機制
PCR由一系列復雜的化學反應，包含前、中、后三個階段。重要的化學變化是熱循環(huán)期間的產(chǎn)物合成。每次循環(huán)后產(chǎn)物、模板、聚合酶、引物和脫氧核苷酸的余量都會改變，處于連續(xù)的不穩(wěn)定狀態(tài)。所有的循環(huán)都是從模板和先前產(chǎn)物的變性開始。當溫度較低時，引物退火到模板上。
早先若干循環(huán)的退火步驟要求引物尋找正確的染色體模板作為它們的目標。在中期的循環(huán)中，先前合成的產(chǎn)物優(yōu)先成為模板。最后幾個循環(huán)中，增擴后的高濃度產(chǎn)物互相雜交，由此阻止與引物的雜交。
引物退火后，Taq DNA聚合酶把自己定位到引物和模板綜合體上，提取介質(zhì)中的自由dNTPs然后沿著模板延伸。從本質(zhì)上講，引物和模板的任何反應都會造成產(chǎn)物擴展，它們的特異性在最初的幾個循環(huán)中可能很難控制，得到非特異性產(chǎn)物的摩爾量超過在模板上正確退火位置的量。PCR反應特異性的可靠度依賴于2個引物必須定位到互補的DNA鏈上。進一步講，退火溫度和Mg2+離子的濃度影響引物穩(wěn)定的雜交到模板上，雜交位置間距應小于10kb。
相比之下，增擴階段的大部分循環(huán)里，模板被很好的與先前增擴的片段區(qū)分開。這些片段的數(shù)量取決于早先若干個循環(huán)的嚴密性。甄選同源性引物的退火位置是較簡單的，增擴期間由染色體DNA貢獻的有效的模板數(shù)量只是可以忽略一小部分。甄選的復雜性被超量由引物從互補位點新增擴的片段所降低。
PCR的化學計量
熱力學方面的影響對PCR來講是試劑濃度和模板間的對應關系。在起先的循環(huán)中PCR試劑的摩爾比率是最高的，隨著PCR產(chǎn)物的增加而降低。令人驚訝的是這種減低是由增擴的目標分子的增加引起的而不是由于試劑的消耗。最初剩余的引物和脫氧核苷酸與模板的比率是固定的，反應結(jié)束后，dNTP的濃度下降超過1倍，引物任然剩余95%，Taq DNA聚合酶沒有變化。增擴千萬倍目標分子后，模板分子遠多于酶分子。當產(chǎn)物增加后，酶全部被占用了，引物和模板的比率減低，推動自身退火。當自身退火的數(shù)量增加或酶的總量有限時，反應處于飽狀態(tài)并停止指數(shù)級的增長。增擴階段是自我受限的。這個階段之后，熱循環(huán)轉(zhuǎn)向未在最初幾個循環(huán)中被選擇的欺騙性的目標增擴，盡管能夠通過提高開始時Taq DNA聚合酶和引物的含量來維持高試劑比率，但這種修改很可能引起丟失特異性因為引物會胡亂雜交，出現(xiàn)額外的條帶和斑點。
熱啟動（hot start）PCR
用于引物設計的位點因為遺傳元件的定位而受限時，如site-directed突變、表達克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動PCR對提高PCR特異性尤為有效。 盡管Taq DNA聚合酶的較佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在PCR配制過程中，熱循環(huán)剛開始，以及保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴增。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應液，并將其置于預熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，無法完全消除非特異性產(chǎn)物的擴增。熱啟動通過抑制DNA合成，直到PCR儀達到變性溫度。方法包括延緩加入Taq DNA聚合酶，在反應體系達到90度時，暫停并保持溫度在70度以上。手工加入聚合酶，這個方法過于煩瑣， 尤其是對高通量應用容易造成污染。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本成分如鎂離子、酶、模板、緩沖液包裹起來，物理地分隔開。熱循環(huán)開始后，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。蠟防護層法與手動熱啟動法一樣比較煩瑣，易受污染，不適用于高通量應用。
還有一種方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗體抑制失活，當變性溫度超過70度時，抗體也變性了，這樣polymerase又被激活了。
Booster PCR
整個PCR反應過程中引物前后擔任2種功能，篩選探針和增擴引導。在最初的幾個熱循環(huán)期間，每個引物作為探針獨立地活動，篩選所有目標。如果一對引物與目標雜交，方向和位置都正確，就意味著目標選擇的工作完成了。接下來在以后的循環(huán)中這對引物引導增擴反應。
增擴低濃度的模板（等于或小于100個模板）比如單個細胞，石蠟化的組織有不同的特點。篩選階段相對于模板而言要有更多剩余的試劑。稀釋的模板造成難以篩選，因為引物和模板相遇和頻率被大大的降低了。這種情況更有可能引起引物之間形成二聚體。Booster PCR是解決這個問題的方法。在此步驟中，第一個循環(huán)階段使用稀釋后的引物和模板取得固定的引物/模板比例，大約在107:1。以確保開始擴增時的準確性，在增擴階段提高引物的濃度到正常水品。
嵌套的引物
如果增擴出的DNA序列嵌套存在于引物退火位置之間，從大范圍看增擴出的目標是同源的。引物雜交的嚴密性在最初若干個循環(huán)里是寬松的，允許較高的錯配偏差。這個效果能通過低于計算得到引物退火溫度來達到。第二步選擇明確的產(chǎn)物，嚴謹?shù)剡x擇一條已知染色體片段用來增擴。簡單點說就是設計兩對引物, 一對是長的，另一對短的是包含在長引物內(nèi)的，用長引物擴增的產(chǎn)物作為第二次擴增的模板，這樣可以增加產(chǎn)物的量而且可以減少非特異性帶和錯配的情況.
假陰性
PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因為酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時PCR時忘了加Taq酶或電泳時忘了加溴化乙錠。
引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物使用過程中應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質(zhì)降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
假陽性
引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設計引物。
靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣器內(nèi)或濺出離心管外。②除了酶及其他不耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及進樣槍頭均應一次性使用。③必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。
出現(xiàn)非特異性擴增帶
PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關。其次，是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶的量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：①必要時，重新設計引物。②減低酶的量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸，也叫兩步法)。
出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶的量過大或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：①減少酶的量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃 度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)
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