1、高效液相色譜儀的基本工作原理
高效液相色譜儀如圖1所示，是由溶液貯器、高壓泵、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜分離柱、檢測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)幾部分組成。
高壓泵從溶液貯器中抽走流動相，流經(jīng)整個(gè)儀器系統(tǒng)，形成密閉的液體流路。樣品通過進(jìn)樣系統(tǒng)注入色譜分離柱，在柱內(nèi)進(jìn)行分離。柱流出液進(jìn)入檢測器，使已被分離的組分逐一被檢測器收集，并將響應(yīng)值轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柡蠼?jīng)放大被數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜峰，通過數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對記錄的峰值進(jìn)行存儲和計(jì)算[1]。
液相色譜儀是依靠色譜柱進(jìn)行分離的。研究證明：物質(zhì)的色譜過程是指物質(zhì)分子在相對運(yùn)動的兩相(液相和固相)中分配“平衡”的過程。液相色譜是以具有吸附性質(zhì)的硅膠顆粒為固定相，各種洗脫液為流動相。當(dāng)液體樣品在載體流動相的推動下，在液-固兩相間作相對運(yùn)動時(shí)，由于各組分在兩相中的分配系數(shù)(K)不同，則使各自的移動速度不同，即產(chǎn)生差速遷移。各組分在兩相間經(jīng)過多次分配，從而達(dá)到使混合物分離的目的。
2、輸液泵的常見故障及對策：
輸液泵/高壓泵是保證HPLC系統(tǒng)流路暢通、流量精確和壓力穩(wěn)定的重要儀器部件，目前多用往復(fù)式恒流柱塞泵，主要由柱塞桿、密封墊圈和兩個(gè)單向閥組成，用馬達(dá)帶動凸輪驅(qū)動柱塞桿作吸液和排液的往復(fù)運(yùn)動。常分為單柱塞泵、并聯(lián)柱塞泵、串聯(lián)柱塞泵和柱塞隔膜泵等類型。流動相混合方式分為低壓混合和高壓混合。常見泵的故障主要有以下幾種，并提供解決的辦法。
2.1單向閥故障 由于球與閥座密封不嚴(yán)，液體倒流，造成壓力不穩(wěn)，甚至球與閥座粘在一起阻死。密封不嚴(yán)主要是污染或氣泡引起，球與閥座粘連也是由于污染和磨損造成。
為避免單向閥中的寶石球和閥座被污染，流動相應(yīng)使用HPLC級的溶劑，并且配好的流動相一定要用0.45u濾膜過濾和脫氣。如果泵被微粒污染，可分別用水、甲醇、異丙醇、二氯甲烷依次沖洗。沖洗時(shí)應(yīng)打開泄液閥，最后再用所用的溶液沖洗整個(gè)系統(tǒng)。
氣泡進(jìn)入閥中會緊貼在閥體的一側(cè)，使寶石球難返回到閥座，引起倒流，泵的壓力和流速會明顯改變。此時(shí)，應(yīng)立即打開泄液閥，大流量(2ml/min)沖洗泵，直至排除液為直線型。因?yàn)榧状伎蓾櫇癖脙?nèi)壁，擠出氣泡，故也可使用脫過氣的甲醇沖洗泵。長期不用的泵或新裝的泵頭應(yīng)該用甲醇趕氣泡。泵進(jìn)氣泡也可在泵頭上排氣泡，即用扳手固定住進(jìn)氣泡的泵頭，擰開輸出管道的壓帽，手動泵送液，可見到氣泡從孔中擠壓出來，直至無氣泡排出將壓帽擰緊。
采取上述辦法仍不能使壓力穩(wěn)定，應(yīng)考慮是否密封墊壞了？或單向閥磨損、球不光滑等，需更換部件。
2.2泵墊圈故障泵墊圈常見的故障是滲漏和墊圈受損污染系統(tǒng)。液相色譜系統(tǒng)一般情況下不要使用強(qiáng)酸強(qiáng)堿溶液，因?yàn)檫@會損壞密封墊和柱塞桿。密封墊圈與運(yùn)動著的柱塞桿緊密接觸，可使柱塞在泵頭自由運(yùn)動而流動相不漏出來，它是液相色譜系統(tǒng)中最易磨損的部件。有條件的實(shí)驗(yàn)室可三個(gè)月更換一次墊圈，防止泵系統(tǒng)污染。如果用緩沖鹽作流動相則更會加速墊圈的磨損，應(yīng)及時(shí)沖洗。當(dāng)墊圈損壞時(shí)，表現(xiàn)為：泵壓力不穩(wěn)、泵頭漏液。一旦出現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象，應(yīng)盡快更換新墊圈。
為避免上述故障的發(fā)生，我們在分析工作中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：
① 使用超純水(18MΩ.cm)、純度級別較高的試劑和色譜級溶劑配制流動相；
?、?配好的流動相一定要抽濾脫氣，即便儀器有在線脫氣裝置，也可以在上機(jī)前進(jìn)行抽濾。真空抽濾既過濾顆粒也脫了氣泡，非常有效。
?、?泵在起動前一定要通過泄液閥抽凈泵里的空氣。
④ 用緩沖鹽洗脫時(shí)，分析結(jié)束后一定要用水沖洗泵和整個(gè)流路系統(tǒng)，不要讓腐蝕性溶液滯留泵中，最后用有機(jī)溶劑充滿系統(tǒng)。
3、色譜分離柱的使用與維護(hù)
在前述儀器工作原理部分，我們已經(jīng)指出，液相色譜儀的分離是在色譜分離柱中實(shí)現(xiàn)的。我們目前工作中多采用反相色譜柱，如何保護(hù)好分離柱減少柱的污染是延長柱壽命的關(guān)鍵。
3.1怎樣維護(hù)好色譜分離柱
加保護(hù)柱(預(yù)柱)是保護(hù)分離柱的有效辦法。保護(hù)柱是根內(nèi)裝填料與分離柱性質(zhì)相近的短柱，接在分離柱之前，或代替流路過濾器。保護(hù)柱的作用是收集和阻塞分離柱口的化學(xué)垃圾，這些垃圾如果直接進(jìn)入分離柱會逐漸堆積在柱頭，最終降低柱效能。保護(hù)柱是消耗品，如分析血漿樣品，一般分析50個(gè)樣品后需更換新柱芯。
避免高壓沖擊分離柱。一般色譜柱都能承受得起高壓，但經(jīng)不住突然變化的高壓沖擊，這將改變柱床體積，影響柱效。引起高壓沖擊的原因主要有：進(jìn)樣器的樣品閥的緩慢轉(zhuǎn)動、泵啟動太快、柱切換等操作。用手動進(jìn)樣閥時(shí)的壓力變化不大，自動進(jìn)樣閥由于切換較慢，可能會造成壓力沖擊。
合理選擇分離柱。我們知道，選擇色譜分離柱主要根據(jù)兩點(diǎn)，一是根據(jù)待測組分的分子量的大?。欢歉鶕?jù)流動相條件，包括PH值、離子強(qiáng)度和溶劑極性等。傳統(tǒng)硅膠基質(zhì)的鍵合相柱要求流動相PH值在3-7之間，極端PH值(>8)的流動相能溶解硅膠，使鍵合相流失。而目前利用先進(jìn)的雜化顆粒技術(shù)研制的高純硅膠顆粒填料(如Waters公司的XTerra色譜柱)，集硅膠和多孔聚合物填料的優(yōu)點(diǎn)為一體，使有機(jī)硅烷單元取代了相當(dāng)一部分占據(jù)顆粒內(nèi)部和表面位置的硅羥基，使這種新型填料具有分辨率高、穩(wěn)定性強(qiáng)、PH范圍寬(1-12)的優(yōu)勢，其性能突破了傳統(tǒng)高效液相色譜柱的極限。所以一定要根據(jù)分析的對象、流動相的條件選擇合適的分離柱，茫然時(shí)可向公司的技術(shù)人員咨詢。
定期沖洗分離柱。每次分析工作結(jié)束時(shí)，沖洗完緩沖鹽后，最后要過度到用強(qiáng)溶劑沖洗柱子，如可用色譜純甲醇、乙腈沖洗反相C18柱，目的是沖去吸附在柱上的強(qiáng)保留組分。如果用甲醇/水為流動相也應(yīng)這樣沖洗柱子，在一定程度上可恢復(fù)柱效。
氣相色譜儀或液相色譜儀操作中，當(dāng)儀器的操作條件保持不變時(shí)，任一物質(zhì)的色譜峰總是在色譜圖上固定的位置出現(xiàn)，即有一定的保留值。又包含：死時(shí)間，保留時(shí)間，校下保留時(shí)間，保留體積等等。
在液相色譜儀中保留值定性的方法主要是用直接與已知標(biāo)準(zhǔn)物對照的方法。當(dāng)未知峰的保留值（t'R或V'R）與某一已知標(biāo)準(zhǔn)物完全相同時(shí)，則未知峰可能與此已知標(biāo)準(zhǔn)物是同一物質(zhì)，特別是在改變色譜柱或改變洗脫液的組成時(shí)，未知峰的保留值與已知標(biāo)準(zhǔn)物的保留值仍能完全相同，則可以基本上認(rèn)定未知峰與標(biāo)準(zhǔn)物是同一物質(zhì)。
在利用保留值數(shù)據(jù)進(jìn)行比對和定性分析時(shí)要特別注意到：由于液相色譜柱的填柱技術(shù)較復(fù)雜，液相色譜儀所使用的色譜柱的重現(xiàn)性目前還很不理想，即使是同一批號的柱子，重現(xiàn)性也不一致，這就使得使用保留值數(shù)據(jù)進(jìn)行分析受到限制。因此，目前保留值數(shù)據(jù)只能作為定性分析的參考?？梢愿鶕?jù)這些數(shù)據(jù)和對樣品的了解來選用已知標(biāo)準(zhǔn)物，再用這些已知標(biāo)準(zhǔn)物與未知物在同一色譜條件下直接進(jìn)行對比。
比較簡單的保留值定性方法是將已知標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加到樣品中去，若使某一峰增高，而且在改變色譜柱或洗脫液的組成后，仍能使這個(gè)峰增高，則可基本認(rèn)定這個(gè)峰所代表的組分與已知標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為同一物質(zhì)。
目前一些液相色譜儀儀器配備了三維圖譜檢測器，如二極管陣列檢測器，在進(jìn)行未知組分與已知標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比對時(shí)，除了比較保留時(shí)間外，還可以比較兩個(gè)峰的立體圖形。如在使用二極管陣列檢測器時(shí)，除了比較未知組分與已知標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間外，還可比較兩者的紫外光譜圖，如果保留時(shí)間一樣，兩者的紫外光譜圖也完全一樣，則可基本上認(rèn)定兩者是同一物質(zhì)；若保留時(shí)間雖一樣，但兩者的紫外光譜圖有較大差別，則兩者不是同一物質(zhì)。這種利用三維圖譜比較對照的方法大大提高了保留值比較定性方法的準(zhǔn)確性。美國Bio-Rad公司的血藥分析儀（Remeeli）就是依靠三維圖譜的綜合數(shù)據(jù)的分析來鑒別未知藥物的。
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