紫外分光光度計(jì)的工作原理
紫外可見分光光度計(jì)的工作原理主要是基于朗伯-比耳定律。18世紀(jì)初，瑯伯在前人的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了物質(zhì)對(duì)光的吸收與物質(zhì)厚度的關(guān)系，并于1760年指出：如果溶液的濃度一定，則光對(duì)物質(zhì)的吸收程度與它通過的溶液厚度成正比，這就是朗伯定律，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：
A=lgI。/I=K。b
式中，A為吸光度；I。為入射光強(qiáng)度；I為透射光強(qiáng)度；b為液層厚度（即光程）；K。為比例常數(shù)。
1852年，比耳研究了各種無(wú)機(jī)鹽的水溶液對(duì)紅光的吸收后指出：光的吸收和光所遇到的吸光度的數(shù)量有關(guān)；如果吸光物質(zhì)于不吸光的溶劑中，則吸光度和吸光物質(zhì)的濃度成正比，這就是比耳定律，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：
A=lgI。/I=K1C
式中，A為吸光度；I。為入射光強(qiáng)度；I為透射光強(qiáng)度；C為溶液的濃度；K1為比例常數(shù)。
將朗伯定律和比耳定律結(jié)合起來(lái)，則為朗伯-比耳定律，公式如下：
A=lgI。/I=K2bC
式中，A為吸光度；I。為入射光強(qiáng)度；I為透射光強(qiáng)度；C為溶液的濃度；b為液層厚度（即光程）；K2為比例常數(shù)。
朗伯-比耳定律認(rèn)為：當(dāng)一束光平行的單色光通過某一均勻的有色溶液時(shí)，溶液的吸光度與溶液的濃度和光程的乘積成正比，這就是朗伯-比耳定律的真正物理意義，它是光度分析中定量分析的基礎(chǔ)、根本的依據(jù)，也是紫外可見分光光度計(jì)的基本原理。
分光光度計(jì)正是根據(jù)朗伯-比耳定律，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量和定性分析的。
由于分光光度計(jì)是一種常用的實(shí)驗(yàn)室分析儀器，所以無(wú)論是從款式上還是價(jià)格上五花八門，一般往往給初購(gòu)者造成眼花繚亂、令人無(wú)所適從的感覺；價(jià)格因素一般是購(gòu)買者首先考慮的問題，盡管分光光度計(jì)種類繁多，但不外乎：簡(jiǎn)易型、中檔型和高檔型三大類：
(1)簡(jiǎn)易型儀器及其特點(diǎn)：
結(jié) 構(gòu)：這種類型的儀器多為單光束型，即只有一束光照射到樣品室內(nèi)；光源一般僅有鎢燈；樣品支架一般為推拉式四聯(lián)池架；波長(zhǎng)選擇多為手動(dòng)查找，重復(fù)性差；狹縫為一個(gè)固定寬度模式；光學(xué)性能指標(biāo)較低；檢測(cè)器多為光敏二極管；顯示器多為機(jī)械表頭或數(shù)碼管顯示器，數(shù)據(jù)處理器一般沒有。此類儀器生產(chǎn)以國(guó)內(nèi)廠家居多。測(cè)量模式：多為定點(diǎn)(固定波長(zhǎng))吸光度或透過率測(cè)量方式，基本不能進(jìn)行波長(zhǎng)掃描測(cè)量。適應(yīng)范圍：小型實(shí)驗(yàn)室及示范教學(xué)，分析樣品相對(duì)簡(jiǎn)單，測(cè)試結(jié)果精度要求不高。價(jià) 格：相對(duì)低廉，一般在2萬(wàn)元人民幣以下，所以還有一定的市場(chǎng)。
(2)中檔型儀器及其特點(diǎn)：
結(jié) 構(gòu)：此類儀器多為雙光束型或準(zhǔn)雙光束型，但也有單光束儀器型；光源有鎢燈和氘燈；樣品池支架為兩個(gè)固定式，分別是樣品通道和參比通道；波長(zhǎng)按照設(shè)定模式自動(dòng)查找或掃描；狹縫多數(shù)仍為2nm固定寬度模式,也有1.5nm狹縫寬度的；檢測(cè)器多數(shù)是硅光二極管，但也有少數(shù)用光電倍增管的；光學(xué)性能相對(duì)較高，其中光柵的技術(shù)指標(biāo)尤為重要，較佳的光柵為凹面型，為此無(wú)論在分辨率還是在雜散光方面指標(biāo)要優(yōu)于簡(jiǎn)易型儀器；顯示器為液晶式或連接電腦，數(shù)據(jù)處理可由儀器自身具有的或外接計(jì)算機(jī)處理。并有一定的測(cè)量附件。測(cè)量模式：透過率、吸光度、濃度直讀、單光束;單點(diǎn)及掃描均可。適應(yīng)范圍：此類儀器基本可滿足大多實(shí)驗(yàn)室分析需要。價(jià) 格：3～10萬(wàn)人民幣之間，此類型儀器占分光光度計(jì)的比例最大。
(3)高檔型儀器及特點(diǎn)：
結(jié)構(gòu)：除了中檔儀器的特點(diǎn)外，主要是光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和制造工藝水平更高了，比如使用了大尺寸的凹面光柵，并且光柵刻槽數(shù)大于1800條/mm;波長(zhǎng)檢測(cè)范圍有的儀器在近紅外區(qū)已經(jīng)超過1100nm，可達(dá)到2600nm;狹縫均為連續(xù)可調(diào)型，以適應(yīng)高分辨率的需要，波長(zhǎng)掃描速度的檔位也增加了，檢測(cè)器均使用高靈敏度的光電倍增管和紅外檢測(cè)器;數(shù)據(jù)處理目前基本是電腦來(lái)執(zhí)行;衡量一臺(tái)儀器的另外一個(gè)指標(biāo)是看此儀器是否具有豐富的附屬測(cè)量器件，如偏振附件、積分球附件、反射附件、自動(dòng)進(jìn)樣器附件、色度分析軟件、薄膜附件等等。測(cè)量模式：透過率、吸光度、濃度直讀、反射方式、能量方式，單點(diǎn)、掃描均可;適應(yīng)范圍：科研、光學(xué)產(chǎn)品的檢測(cè)、生化樣品檢測(cè)、復(fù)雜樣品檢測(cè)等。不但可以測(cè)液態(tài)樣品，也可測(cè)固態(tài)樣品。
熒光分光光度計(jì)的特點(diǎn)：
1.熒光激發(fā)光譜
選定某一熒光發(fā)射波長(zhǎng)記錄熒光發(fā)射強(qiáng)度作為激發(fā)光波長(zhǎng)的函數(shù)，即得熒光激發(fā)光譜。
2.熒光發(fā)射光譜
選擇某一固定波長(zhǎng)的光激發(fā)樣品，記錄樣品中產(chǎn)生的熒光發(fā)射強(qiáng)度與發(fā)射波長(zhǎng)間的函數(shù)關(guān)系，即得熒光發(fā)射光譜。
3.時(shí)間分辨技術(shù);
可用于對(duì)混合物中光譜重疊但有壽命差異的組分進(jìn)行分辨并分別測(cè)量。
熒光分光光度計(jì)的組成部分：
1.光源：
為高壓汞蒸氣燈或氙弧燈，后者能發(fā)射出強(qiáng)度較大的連續(xù)光譜，且在300nm～400nm范圍內(nèi)強(qiáng)度幾乎相等，故較常用。
2.發(fā)射單色器：
置于樣品室和檢測(cè)器之間的為發(fā)射單色器或第二單色器，常采用光柵為單色器。篩選出特定的發(fā)射光譜。
3.激發(fā)單色器：
置于光源和樣品室之間的為激發(fā)單色器或第一單色器，篩選出特定的激發(fā)光譜。
4.樣品室：
通常由石英池(液體樣品用)或固體樣品架(粉末或片狀樣品)組成。測(cè)量液體時(shí)，光源與檢測(cè)器成直角安排;測(cè)量固體時(shí)，光源與檢測(cè)器成銳角安排。
5.檢測(cè)器：
一般用光電管或光電倍增管作檢測(cè)器?？蓪⒐庑盘?hào)放大并轉(zhuǎn)為電信號(hào)。
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