液相色譜法是一種以液體為流動(dòng)相的色譜法，液相色譜法是現(xiàn)在應(yīng)用十分廣泛的一種液相色譜法，這種方法是20世紀(jì)60年代興起的，經(jīng)過(guò)不斷的完善和發(fā)展，現(xiàn)已被應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。在醫(yī)藥分析領(lǐng)域，液相檢驗(yàn)的應(yīng)用已經(jīng)普及，而液相色譜法作為液相檢驗(yàn)中的一種重要手段，也得到了大力的推廣與應(yīng)用，目前實(shí)驗(yàn)室常用的P230液相色譜儀。
液相色譜法及其系統(tǒng)構(gòu)造
液相色譜法是以經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，通過(guò)引入氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來(lái)的。區(qū)別于經(jīng)典液相色譜法柱效低、時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)，液相色譜法采用了高壓泵、固定相和高靈敏度檢測(cè)器等技術(shù)，因此其檢測(cè)有高壓、高速、、高靈敏度、檢驗(yàn)速度快、分辨率高等特點(diǎn)，更適宜于分離、分析熱穩(wěn)定性差、高沸點(diǎn)、有生理活性及相對(duì)分子量比較大的物質(zhì)。
HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、溶劑貯存器、檢測(cè)器、檢測(cè)數(shù)據(jù)記錄器等組成。其中輸液泵、色譜柱和檢測(cè)器關(guān)鍵。制備型HPLC儀有餾分收集裝置。新型HPLC儀增加了微機(jī)控制，可進(jìn)行自動(dòng)化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。
輸液泵性能的好壞直接影響分析結(jié)果的可靠性，好的輸液泵應(yīng)具備輸出壓力高，流量穩(wěn)定、耐腐蝕，密封性能好，液缸容積小等特點(diǎn)；HPLC進(jìn)樣方式可分為：隔膜進(jìn)樣、閥進(jìn)樣、停流進(jìn)樣、自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣裝置需要：密封性能好，重復(fù)性好，死體積小，對(duì)色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響??；色譜柱擔(dān)負(fù)分離作用，是色譜系統(tǒng)的心臟，在選擇色譜柱時(shí)要注意選擇柱效高、選擇性好，分析速度快的色譜柱；檢測(cè)器是把洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，其要求線(xiàn)性范圍寬、靈敏度高、重復(fù)性好、噪音低和適用范圍廣。
液相色譜的原理及分類(lèi)
液相色譜的原理主要依靠分離機(jī)制，其分離方法有多種，相應(yīng)的分離機(jī)制也不同。根據(jù)分離機(jī)制的不同主要有四種基本類(lèi)型色譜法：吸附色譜、分配色譜、分子排阻色譜及離子交換色譜法，其他還有膠束色譜法、化學(xué)鍵合色譜法及親和色譜法等類(lèi)別。在液相檢驗(yàn)中，分離是核心，而色譜是一種分離分析手段。無(wú)論是那種分離方法，其分離原理都是一個(gè)物理過(guò)程，與液相層析的原理相似：將要檢測(cè)分析的化合物通過(guò)進(jìn)樣器放入液相色譜儀，流動(dòng)相攜帶著其流過(guò)色譜柱，由于不同物質(zhì)在固定相上的保留時(shí)間不同出現(xiàn)的峰高或者峰面積定量以及出峰時(shí)間的不同而達(dá)到分離，從而或檢測(cè)藥物中不同成分的含量、或分析藥效，或測(cè)定藥物殘留物雜質(zhì)成分的濃度。
藥物含量檢驗(yàn)中液相色譜的應(yīng)用
藥物含量檢驗(yàn)中定量分析的準(zhǔn)確與否，關(guān)鍵在于檢測(cè)器所產(chǎn)生的信號(hào)是否與被測(cè)樣品的量始終呈一定的函數(shù)關(guān)系。液相色譜儀可使輸出信號(hào)與樣品量好呈線(xiàn)性關(guān)系，這樣進(jìn)行定藥物含量測(cè)定時(shí)既準(zhǔn)確又方便。
例如，示差檢測(cè)法就是用液相色譜測(cè)定多糖類(lèi)藥物，用電化學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)的陰離子交換柱分離出多糖類(lèi)藥物，這種方法優(yōu)于傳統(tǒng)檢驗(yàn)法，可直接對(duì)低濃度糖作定量分析，不需衍生和樣品處理，在節(jié)約時(shí)間和資金的同時(shí)避免了有毒衍生試劑的使用。在檢驗(yàn)中不同類(lèi)型的糖(如單糖、糖胺聚糖、半乳糖、果糖等)適用于不同的離子交換柱。
藥效檢驗(yàn)中液相色譜的應(yīng)用
藥物的治療效果取決于人體對(duì)藥物的吸收，與藥物成分及其代謝物在血液中的濃度有關(guān)。隨著現(xiàn)代藥物的選擇性越來(lái)越高，所服用的劑量越來(lái)越低，這就需要提高藥效。現(xiàn)階段藥效臨床試驗(yàn)中采用人肝組織，選擇液相色譜法檢測(cè)藥性藥效，對(duì)混合物中微量組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，可搭配固定相和流動(dòng)相以達(dá)到好的分離效果。
例如，用內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)血液中藥物濃度的總量限度。內(nèi)標(biāo)法是液相色譜的一種常用測(cè)定方法。首先提取血液，然后根據(jù)規(guī)定的方法配制不含藥物的溶液，注入到液相色譜儀中，記錄為色譜圖I，然后再配制含有藥物的溶液，以相同的條件注樣，記錄為色譜圖II。然后將圖I與圖II進(jìn)行比較，則可以通過(guò)雜質(zhì)峰確認(rèn)雜質(zhì)峰的面積，從而達(dá)到檢驗(yàn)的效果。
藥物殘留中液相色譜的應(yīng)用
通常藥物在使用一段時(shí)間后在體內(nèi)產(chǎn)生殘留物會(huì)影響認(rèn)得某些生理功能，也就是人們所說(shuō)的食藥三分毒，如何分析藥物殘留物成分，減少其引起的不必要危害，液相色譜法起到了重要的作用。質(zhì)譜儀是完成藥物代謝物毒性鑒定的主要工具，是制藥工業(yè)中毒理學(xué)試驗(yàn)的基礎(chǔ)。
今后的醫(yī)藥分析檢驗(yàn)研究中，可以應(yīng)用液相色譜法不受試樣揮發(fā)性限制等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合其它的先進(jìn)技術(shù)，如色譜——光譜聯(lián)用、柱切換技術(shù)、傅立葉變換紅外線(xiàn)吸收光譜聯(lián)用等，不斷提高液相色譜在液相檢驗(yàn)中的應(yīng)用。
高效液相色譜法與氣相色譜法一樣，都屬于色譜法，具有選擇性高、分離效率高、靈敏度高、分析速度快等特點(diǎn)。下面就兩種色譜法的應(yīng)用范圍、儀器構(gòu)造等不同點(diǎn)進(jìn)行比較。
一、氣相與液相的概念
氣相
氣相色譜是一種物理的分離方法。利用被測(cè)物質(zhì)各組分在不同兩相間分配系數(shù)(溶解度)的微小差異，當(dāng)兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，這些物質(zhì)在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次的分配使原來(lái)只有微小的性質(zhì)差異產(chǎn)生很大的效果而使不同組分得到分離。
液相
高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上引用了氣相色譜的理論。在技術(shù)上，流動(dòng)相改為高壓輸送；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而,使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜(每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬(wàn)或幾十萬(wàn))；同時(shí)，柱后連有高靈敏度的檢測(cè)器可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。
二、應(yīng)用范圍
氣相
有著分離能力好、靈敏度高、分析速度快、操作方便等特點(diǎn)。受技術(shù)條件的限制，沸點(diǎn)太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng)用氣相色譜法進(jìn)行分析，一般對(duì)500℃以下不易揮發(fā)或受熱易分解的物質(zhì)部分可采用衍生化法或裂解法。
液相
高效液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要?dú)饣?，因此，不受試樣揮發(fā)性的限制。對(duì)于高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、相對(duì)分子量大(大于400以上)的有機(jī)物(些物質(zhì)幾乎占有機(jī)物總數(shù)的75%～80%)。原則上，都可應(yīng)用高效液相色譜法來(lái)進(jìn)行分離、分析。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在已知化合物中能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70～80%。
三、氣相儀器構(gòu)造
由載氣源、進(jìn)樣部分、色譜柱、柱溫箱、檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。進(jìn)樣部分、色譜柱和檢測(cè)器的溫度均在控制狀態(tài)。
1.柱箱：
色譜柱是氣相色譜儀的心臟，樣品中的各個(gè)組份在色譜柱中經(jīng)過(guò)反復(fù)多次分配后得到分離，從而達(dá)到分析的目的，柱箱的作用就是安裝色譜柱。由于色譜柱的兩端分別連接進(jìn)樣器和檢測(cè)器，因此，進(jìn)樣器和檢測(cè)器的下端(接頭)均插入柱箱。柱箱能夠安裝各種填充柱和毛細(xì)管柱并且操作方便。色譜柱(樣品)需要在一定的溫度條件下工作，因此，采用微機(jī)對(duì)柱箱進(jìn)行溫度控制，并且由于設(shè)計(jì)合理，柱箱內(nèi)的梯度很小。
對(duì)于一些成份復(fù)雜、沸程較寬的樣品，柱箱還可進(jìn)行三階程序升溫控制。且程序設(shè)定后自動(dòng)運(yùn)行無(wú)需人工干預(yù)，降溫時(shí)還能自動(dòng)后開(kāi)門(mén)排熱。
2.進(jìn)樣器：
進(jìn)樣器的作用是將樣品送入色譜柱。如果是液體樣品，進(jìn)樣器還必須將其汽化。因此，采用微機(jī)對(duì)進(jìn)樣器進(jìn)行溫度控制。
根據(jù)不同種類(lèi)的色譜柱及不同的進(jìn)樣方式，共有五種進(jìn)樣器可供選擇：
填充柱進(jìn)樣器
毛細(xì)管不分流進(jìn)樣器附件
毛細(xì)管分流進(jìn)樣器附件
毛細(xì)管分流/不分流進(jìn)樣器
六通閥氣體進(jìn)樣器
3.檢測(cè)器：
檢測(cè)器的作用是將樣品的化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為物理信號(hào)(電信號(hào))。
檢測(cè)器也需要在一定的溫度條件下才能正常工作，因此，采用微機(jī)對(duì)檢測(cè)器進(jìn)行溫度控制。
根據(jù)各種樣品的化學(xué)物理特性，共有五種檢測(cè)器可供選擇：
氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)；
熱導(dǎo)檢測(cè)器(TCD)；
電子捕獲檢測(cè)器(ECD)；
氮磷檢測(cè)器(NPD)；
火焰光度檢測(cè)器(FPD)；
4.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：
該系統(tǒng)可對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開(kāi)展。
四、高效液相儀器構(gòu)造
高效液相色譜儀主要有：進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。
1.進(jìn)樣系統(tǒng)
一般采用：隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作，進(jìn)樣量是恒定的。這對(duì)提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。
2.輸液系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括高壓泵、流動(dòng)相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為l.47～4.4×107Pa流速可調(diào)且穩(wěn)定，當(dāng)高壓流動(dòng)相通過(guò)層析柱時(shí)，可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動(dòng)速度，這對(duì)提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動(dòng)相貯存錯(cuò)和梯度儀，可使流動(dòng)相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、pH值。
3.分離系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括：色譜柱、連接管和恒溫器等。
色譜柱一般長(zhǎng)度為10～50cm(需要兩根連用時(shí)，可在二者之間加一連接管)內(nèi)徑為2～5mm，由優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，柱內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相(由基質(zhì)和固定液構(gòu)成)，固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹(shù)脂或硅膠構(gòu)成，它們都有惰性(如，硅膠表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性和比表面積大的特點(diǎn)，加之其表面經(jīng)過(guò)機(jī)械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣)或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因(如，磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長(zhǎng)度碳鏈的烷基等)或配體的有機(jī)化合物。
因此，這類(lèi)固定相對(duì)結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性，例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素(PSA)后，就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來(lái)。
另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達(dá)到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)?；|(zhì)粒度小、微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對(duì)縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論分析，基質(zhì)粒度小，塔板理論數(shù)N就越大。
這也進(jìn)一步證明基質(zhì)粒度小，會(huì)提高分辨率的道理。再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60℃通過(guò)改善傳質(zhì)速度，縮短分析時(shí)間，就可增加層析柱的效率。
4.檢測(cè)系統(tǒng)
高效液相色譜常用的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器三種：
(1)紫外檢測(cè)器
該檢測(cè)器適用于對(duì)紫外光(或可見(jiàn)光)有吸收性能樣品的檢測(cè)。
其特點(diǎn)：使用面廣(如，蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用)；靈敏度高(檢測(cè)下限為10-10g/mL)；線(xiàn)性范圍寬；對(duì)溫度和流速變化不敏感；可檢測(cè)梯度溶液洗脫的樣品。
(2)示差折光檢測(cè)器
凡具有與流動(dòng)相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)；糖類(lèi)化合物的檢測(cè)使用此檢測(cè)系統(tǒng)。這一系統(tǒng)通用性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，但是，靈敏度低(檢測(cè)下限為10-7g/mL)，流動(dòng)相的變化會(huì)引起折光率的變化；因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測(cè)。
(3)熒光檢測(cè)器
凡具有熒光的物質(zhì)，在一定條件下，其發(fā)射光的熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比。因此，這一檢測(cè)器只適用于具有熒光的有機(jī)化合物(如，多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類(lèi)、維生素和某些蛋白質(zhì)等。。。)的測(cè)定，其靈敏度很高(檢測(cè)下限為10-12～10-14g/mL)痕量分析和梯度洗脫作品的檢測(cè)均可采用。
5.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
該系統(tǒng)可對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開(kāi)展。
五、高效液相色譜與氣相色譜法優(yōu)點(diǎn)和不足分析
只有20%樣品可不經(jīng)化學(xué)處理而能滿(mǎn)意地用氣相色譜分離，80%的有機(jī)化合物要用高效液相色譜分析。
氣相色譜中流動(dòng)相是惰性的，它對(duì)組分沒(méi)有作用力，僅起運(yùn)載作用、而高效液相色譜的流動(dòng)相不僅起運(yùn)載作用，而且流動(dòng)相對(duì)組分有一定親合力，可以通過(guò)改變流動(dòng)相種類(lèi)和組成提高分離的選擇性；另外，可作流動(dòng)相的化合物多，選擇余地廣。
與氣相色譜相比，高效液相色譜儀的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是：樣品的回收比較容易，只要開(kāi)口容器放在柱子末端，就可以很容易地將所分離的各組分收集。回收是定量的，可以用來(lái)提純和制備具有足夠純度的單一物質(zhì)。
高效液相色譜不足的是，日前，檢測(cè)器的靈敏度不及氣相色譜。必須特別注意“柱外效應(yīng)”對(duì)柱效率及色譜分離的影響。
以上內(nèi)容由捷配儀器儀表網(wǎng)小編為您整理提供，希望能幫到您，祝您工作學(xué)習(xí)愉快
在我們常規(guī)思維中，色譜柱上標(biāo)示的流向是不可改變的，每次使用都要遵循?？墒牵蠹矣袥](méi)有想過(guò)這個(gè)方向的作用是什么呢？為什么要標(biāo)示一個(gè)使用方向呢？
其實(shí)色譜柱前后端的填料及填裝工藝都是一樣的，標(biāo)示方向的目的就是讓我們?cè)谑褂弥杏涀×鲃?dòng)相從哪個(gè)方向流入色譜柱，那么這個(gè)流入段就是最先污染端。這樣就為我們?nèi)蘸缶S護(hù)或再生色譜柱做了準(zhǔn)備，而我們需要遵循這個(gè)規(guī)定應(yīng)該在色譜柱開(kāi)始做樣后。
我曾將已經(jīng)污染過(guò)的色譜柱反方向來(lái)使用，如果保留時(shí)間不是很長(zhǎng)，而色譜柱足夠長(zhǎng)，還是能使用一段時(shí)間的。
2.不去看說(shuō)明書(shū)，直接就上機(jī)使用
色譜柱內(nèi)部保存著什么溶劑一定要看清楚，因此色譜柱的說(shuō)明書(shū)一定要看清楚，當(dāng)然也包括說(shuō)明書(shū)上建議的維護(hù)保養(yǎng)規(guī)定，對(duì)我們都非常的有用。對(duì)于反相柱來(lái)說(shuō)，溶劑基本就是乙腈或甲醇。但正相柱就不同了，因?yàn)檎嘀丝梢赃m用正相系統(tǒng)，也可以適用反相系統(tǒng)，因此一定要看清楚，對(duì)于你的方法來(lái)說(shuō)是否需要置換色譜柱內(nèi)部保存溶劑。
3.用純水沖洗色譜柱才能把緩沖液沖洗干凈
使用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱對(duì)內(nèi)部填料的損傷是最大的，尤其是純水，除非你的色譜柱是耐水的。沖洗色譜柱可以的方法是用流動(dòng)相比例的水系和有機(jī)系來(lái)沖洗。如果你認(rèn)為流動(dòng)相比例無(wú)法把色譜柱沖洗干凈或者此比例中有機(jī)系占有比例過(guò)大，你可以使用內(nèi)含10%左右的純水來(lái)沖洗。
4.保存在乙腈或甲醇中的新色譜柱可以直接使用
理論上液相色譜柱不同于氣相色譜柱需要活化，但是由于液相色譜柱內(nèi)部保存的有機(jī)系具有揮發(fā)性，因此在使用前還是應(yīng)該用小流速的和色譜柱內(nèi)部相同的溶劑沖洗一定的時(shí)間。可以是0.5ml/min，120min，但可以咨詢(xún)廠(chǎng)家，根據(jù)色譜柱參數(shù)設(shè)定。
5.色譜柱應(yīng)該保存在純乙腈或甲醇中
根據(jù)第4條，色譜柱內(nèi)部保存液具有揮發(fā)性，因此為了減少其揮發(fā)速度，可以添加5%-10%的水，這樣的話(huà)可以在一定程度上減少一些有機(jī)系的揮發(fā)。如果再增加一個(gè)保險(xiǎn)，我們可以在堵緊堵頭后，再用封口膜封起來(lái)。同樣道理，色譜柱一段時(shí)間不用后，也應(yīng)該按照第4條，進(jìn)行小流速的沖洗色譜柱。
6.色譜柱污染后把篩板卸下來(lái)超聲清洗
對(duì)于色譜柱的污染，首當(dāng)其沖的就是篩板，因此我們常用的做法就是把柱頭卸下來(lái)，把篩板拿去超聲清洗。但是我們?cè)诓鹦哆^(guò)程中對(duì)色譜柱前端填料的損害遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于污染照成的傷害，因?yàn)槲覀儾皇菍?zhuān)業(yè)的。因此建議這一步能不做就不做。
7.自己填裝色譜柱
和第6條相同，這一步做法幾乎可以把此色譜柱判死刑了，我們的填裝工具有什么呢？就是手工的，其填裝壓力遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于工廠(chǎng)內(nèi)原始的填裝壓力。那么我們填裝的結(jié)果會(huì)是個(gè)什么樣也就很明顯了。
在我看來(lái)，自己填裝也就是練練手，熟悉一下這個(gè)過(guò)程，要把色譜柱維修好的可能性幾乎為零。
8.用異丙醇沖洗再生后，柱子效果更差了
這種情況我自己就遇到過(guò)，還好那根柱子本來(lái)就打算報(bào)廢了，因此也沒(méi)有照成多少損失。但是這是什么原因呢？其實(shí)很簡(jiǎn)單，就是在我反向沖洗前沒(méi)有把管路中的污染物沖洗干凈就直接接了柱子。所以說(shuō)，方法是沒(méi)有錯(cuò)的，色譜柱受污染時(shí)，我們應(yīng)該先想到儀器也污染了！
449717568
