反相色譜是迄今在高效液相色譜中應用廣泛的技術，主要是因為它適用于分析極大多數的非極性物質和很多的可離子化的及離子化合物。大多數用于反相色譜的固定相都是天然的疏水物質，因此，分析物是按照它們與固定相的疏水相互作用的大小來分離的，含有疏水的機制也能以同樣的保留方式分離。 固定相上還有少數物質，如混合相（例如苯基－己基）、末端封閉和非末端封閉種類和極性嵌入相－也存在于這些鍵合硅膠上。還有很多填料用于反相色譜，包括聚 合物，聚合物表面涂上硅膠和氧化鋁，無機－有機混合物，涂層氧化鋯，和石墨化碳。不同種類的固定相有他們自己的優(yōu)點和缺點。 反相色譜柱利用各種流動相和添加物可以有很多的應用。一些技術利用添加物可以改變或修飾填料的表面。有時候這些添加物有可能會污染鍵合相表面。硅膠表面因為有著疏水鍵合相而有一些別的化學性質。殘留的硅烷醇存在于所有的硅膠鍵合填料中。這些硅烷醇具有弱酸性，因此能與某些待分析物合基質成分，特別 是堿性成分。因為硅烷醇的pKa值大約是4.5，離子化能在中性pH條件下發(fā)生因此與陽離子產生靜電相互作用就有可能發(fā)生。較老的A型硅膠能容納高濃度金 屬離子（有時候100ppm或更多），而這能使硅膠表面的酸性更大甚至能發(fā)生金屬鰲合現(xiàn)象或清除一些化合物。殘留硅烷醇在非末端封閉的硅膠合短鏈鍵合相如 C2或C4上更讓人煩惱。 使用者必須清楚他們所用的固定相表面特殊性質和可能的分析物－固定相表面的相互作用，這樣當他們使用反相方法時才能考慮到可能的基質相互作用。例如，非常 疏水的樣品基質如玉米油，高芳香物質，和蠟能粘住固定相裝填表面并且改變他們的性質。含有蛋白質物質的生物流體也能吸附在裝填表面。盡管分析者想盡最大努 力來保護HPLC柱子，某些分析物－基質污染能使固定相受到有害的影響。 當柱子被污染，它的色譜行為和沒被污染的柱子會有些不同。被污染的柱子能產生反壓問題。 被污染的反相柱子必須清洗和再生才能恢復原來的操作條件。這部分的"柱子觀察"將討論可行的方法使柱子回復原來的或差不多原來的狀態(tài)。因為鍵合硅膠柱子是 較受歡迎的，我重點講述這種柱子。最后，我將討論別的反相柱子的清潔步驟。 什么導致反相柱子污染產生？通常，樣品中含有一些對分析者來說不感興趣的東西。鹽、脂質、含脂物質、腐質酸、疏水蛋白質和其它一些生物物質是一些可能在使用時與HPLC柱發(fā)生相互作用的物質。這些物質有比分析者的目標物或少或大的保留值。那些保留值較小的物質如鹽類一般來說在空體積時就被沖出色譜柱。這些非目標產物的干擾能被檢測器檢測到而且能形成色譜峰，氣泡，基線上移或者是負峰。如果樣品成分在柱子中有很強的保留而且流動相溶液成分不足以把這些物質洗脫下來，多次上樣后，這些吸附在柱子表面的物質通常就會積累在柱頭。這些行為通常只有通過平行實驗才能發(fā)現(xiàn)。有著中等保留值的樣品能被緩慢洗出而且表現(xiàn)為寬峰，基線擾動，或者基線漂移。 有時候這些被吸附的樣品成分累積到一定程度足以使他們開始形成新的固定相。分析物能與這些雜質作用形成一定的分離機理。保留時間會波動，拖尾會出現(xiàn)。如果足夠的污染產生，柱子的反壓能超過泵所能承受的最大壓力，使柱子無法工作以及在堵塞處產生空體積。 再生被污染HPLC柱子的關鍵是知道污染物的性質并且能找到適當的溶劑來去除。如果污染是因為重復進樣時強保留物質的累積引起的，利用簡單的步驟來除去這些污染物往往能恢復其色譜行為。有時候，經過多次操作以后的色譜柱用90～100％的溶劑B（雙溶劑反相系統(tǒng)中較強的溶劑）沖洗20個體積可以清除污染物。 例如，柱子中殘留的脂質就能用非水溶劑如甲醇、乙晴、四氫 呋喃。 如果你使用的是緩沖液系統(tǒng)，不要直接切換到強溶劑，突然轉換到高濃度有機溶劑可能會使HPLC流動體系中的緩沖液沉淀，這樣會導致更大的問題如柱頭 堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進樣閥轉軸失靈。應該先用無緩沖流動相（即把緩沖液換成水）。沖洗5～10個體積以后才更換強溶劑。 有時候，強溶劑也沒法把殘留在色譜柱上的污染物洗掉。那么更強的溶劑或者是一系列溶劑就有必要用來清洗柱子了，如果污染物是非生物物質，使用者可以跳過一個或多個另外的有機溶劑去除污染物。溶劑與溶劑之間的組合有很多。到柱子廠家的網頁上能找到推薦的溶劑系統(tǒng)。 一般來說，所有的清洗方法都有類似的形式。所用的溶劑都是隨溶劑強度增加，經常最后一個溶劑是非常疏水的（如醋酸乙酯甚至是烴），可以用來溶解非極性物質 如脂質和油類。我們必須保證一系列溶劑中每個溶劑都能與下一個溶劑互混。 清洗過程要結束時，必須借助一個中等強度能互混的溶劑而回到原始溶劑系統(tǒng)。例如， 異丙醇是一個非常好的作為中間步驟的溶劑，因為它能與正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶。但是異丙醇粘度非常大，必須確保較低的流速以免使泵壓過高。 當然，如果使用紫外檢測器的話，避免溶劑在紫外區(qū)域有吸收，要不然需使用大量的溶劑沖洗才能使基線平穩(wěn)。 對于典型的硅膠鍵合柱來說如果沒有緩沖溶液的話推薦使用以下溶劑系列：100％甲醇100％乙晴75％乙晴－25％異丙醇100％異丙醇100％二氯甲烷100％正己烷 用二氯甲烷或正己烷以后，由于溶劑相容性柱子必須用異丙醇沖洗后才能用原來的水相溶劑。每種溶劑至少沖洗10個柱體積。如250mm×4.6mmHPLC 分析柱，分析者可以用1～2ml/min的流速來沖洗，要回復原來的溶劑體系，不需要每一步都沖洗，可以跳過中間步驟。中間步驟推薦使用異丙醇，然后用沒 有緩沖的流動相，最后回復起始流動相配置。四氫呋喃是另外一種比較受歡迎的去除污染的溶劑。如果使用者懷疑柱子被嚴重污染，可以二甲基亞砜（DMSO）或 者二甲基甲酰銨和水按50：50的比例混合用低于0.5ml/min的流速流過色譜柱。成功再生反相柱子是一個非常耗時間的過程，溶劑沖洗可以利用梯度系統(tǒng)過夜操作。