進樣閥在進樣過程中，必須是非常清潔的，否則得不到較好的結(jié)果。

進樣閥切換到進樣位置后（Inject），要在此位置上保持一段時間，使流動相充分沖洗樣品定量管，這樣可以保證有較高的精確度，而且不用另外再沖洗樣品定量管。這種有色譜儀器控制的沖洗顯然要比手動沖洗的更好些。

注意：沖洗需要的流動相體積至少為所進樣品的10倍。例如，如果取20ul樣品至100ul的定量管中，而流動相此時的流速為1ml/min，則需要在進樣位置上至少保持12s，即：20ul×10/1000ul·min-1＝0.2min＝112s。

當樣品定量管經(jīng)過充分的沖洗后，可以將旋柄轉(zhuǎn)回取樣位置(Load)，也可以繼續(xù)保持在進樣位置，到下次取樣前才切換回取樣位置。在切換回取樣位置時，將樣品進樣針或微量樣品進樣針從進樣閥中拔出。

為防止交叉污染，正常情況下不必每次進樣后都清洗進樣閥注射針導入口。進樣閥內(nèi)根據(jù)專利設(shè)計的直接連接進樣孔，可以使注射針頭的前端直接連接到樣品定量管的末端，沒有其他空間供樣品殘留。這樣在下一次進樣時，就不會有上一次殘留的樣品進入定量管。 但是進樣針頭插入或撥出過程中，會有痕量的樣品沉積在針頭密封區(qū)域。精密的測定顯示這種殘留有1nl-10nl。這表明進20ul樣品，會殘留0.005%～0.05%。每次進樣后沖洗注射針導入口可以將此殘留沖洗干凈。

沖洗注射針導入口的過程為：設(shè)定流動相流速為0.1ml/min～1ml/min，將注射針導入口沖洗頭連接到一只體積較大的注射器上，用大量的流動相只在進樣位置清洗注射針導入口。這樣進入進樣閥中的液體繞過樣品定量管由樣品溢出管口排出。這一過程可以將注射針導入口、引導管、注射針導入管和注射針密封圈徹底清洗。而采用注射器完全插入式的沖洗方式，則不能全部清洗上述部件的表面。在取樣位置將注射針插入注射針導入口時，針頭推動注射針密封圈內(nèi)少量樣品液體（上一次沖洗注射針導入管留下的）進入樣品定量管。當該樣品液體與所用的流動相組成不同，且同時采用部分充滿定量管的進樣方式時，在高靈敏度的檢測器上可能出現(xiàn)怪峰。

所以沖洗注射針時可以用流動相沖洗。

如果已發(fā)現(xiàn)有嚴重的交叉污染現(xiàn)象，請檢查是否有下列原因造成：

1.使用的注射針頭長度不夠（針頭的長度至少5cm），注射針末端不能到達定子表面。 2.注射針沒有充分插入注射針導入口。 3.注射針導入口的污染物或針頭密封磨損下來的削片，使注射針末端不能接觸定子表面。

如果不考慮交叉污染，每進樣10次，或20次可以沖洗一下注射針導入口，這樣可以保證注射針導入管內(nèi)充滿流體。在注射針插入或拔出的過程中，清洗注射針頭或稀釋污染這一區(qū)域的樣品的同時也使注射針導入口和樣品溢出口充滿流體，從而防止空氣進入樣品管。?

?

    超高效液相色譜儀與普通高效液相色譜原理相同，因此，在使用中應注意的問題是相同的。    要想成為一個合格的色譜分析者，良好的實驗規(guī)范與習慣是非常必要的。一些小細節(jié)的失誤或忽視一些簡單的問題往往導致實驗結(jié)果不理想或損壞儀器，從而造成重大的損失。    而在使用中從最初的樣品準備開始也有細節(jié)部分需要注意：    在保證目標物回收率的情況下，盡量除去樣品中其它雜質(zhì)。    選用合適的濾膜（濾膜有水溶型、脂溶型、通用型、超高效液相色譜用0.2?m）過濾樣品，確保樣品中不含固體顆粒。可以使用與初始流動相組成相同的溶劑溶解樣品，在反相分析時，用比流動相極性更低的有機相；在用正相分析時，如在親水色譜分析時，溶解樣品的一定是高極性有機相，否則，會引起色譜峰的變形，比如保留時間提前、雙峰等。    在保證靈敏度與準確度的前提下，進樣量要盡量小。

? 一、

基質(zhì)填料

　　1、正相色譜正相色譜用的固定相通常為硅膠（Silica）以及其他具有極性官能團胺基團，如（NH2，APS）和氰基團（CN，CPS）的鍵合相填料。

　　由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他極性基團極性較強，因此，

的次序是依據(jù)樣品中各組分的極性大小，即極性較弱的組份最先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如正已烷（Hexane），氯仿（Chloroform），二氯甲烷（MethyleneChloride）等。

　　2、反向色譜反向色譜用的填料常是以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對較弱官能團的鍵合相。反向

所使用的流動相極性較強，通常為水、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強的組分最先被沖洗出，而極性弱的組分會在色譜柱上有更強的保留。

　　常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。

　　二、聚合物填料聚合物填料多為聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其重要優(yōu)點是在PH值為1—14均可使用。相對于硅膠基質(zhì)的C18填料，這類填料具有更強的疏水性；大孔的

對蛋白質(zhì)等樣品的分離非常有效?，F(xiàn)有的聚合物填料的缺點是相對硅膠基質(zhì)填料，色譜柱柱效較低。

　　三、其它無機填料其它HPLC的無機填料色譜柱也已經(jīng)商品化由于其特殊的性質(zhì)，一般僅限于特殊的用途。如，石墨化碳黑正逐漸成為反向色譜柱填料。這種填料的分離不同于硅膠基質(zhì)烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎(chǔ)，不再需其它的表面改性。該柱填料一般比烷基鍵合相硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強。石墨化碳可用于分離某些幾何異構(gòu)體，由于在HPLC

相中不會被溶解，這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可以用于HPLC。氧化鋁微粒剛性強，可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床，其優(yōu)點是可以在PH高達12的流動相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物的作用也很強，應用范圍受到一定限制，所以未能廣泛應用。新型色譜氧化鋯基質(zhì)填料也可用于HPLC。商品化的只有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應用PH1-14，溫度可達100℃。由于氧化鋯填料是最近幾年才開始研究，加之面臨的實驗難度，其重要用途與優(yōu)勢尚在進行之中。

　　怎樣選擇填料粒度目前，商品化的色譜填料粒度從1um到超過30um均有銷售，而目前分析分離主要用3和5um填料進行。填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數(shù)，即柱效和背壓。粒度越小，柱壓越大，柱壓的增加限制了粒度小于3um的填料應用。在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是唯一的因素。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選用更小的粒度的填料是很有用的。3um填料填充柱的柱效比相同條件下的5um填料的柱效提高近 30%；然而，3um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍。與此同時，柱效提高意味著在相同條件下可以選用更短的色譜柱，即相同的塔板數(shù)或分離能力，但是柱長更短，以縮短分析時間。另外，可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。