1.使用常規(guī)要求

: 為了保證

長(zhǎng)壽命,

基質(zhì)色譜柱的使用pH范圍是2-7,超出此范圍的色譜柱壽命與功能團(tuán)結(jié)構(gòu)有關(guān),但是偏離2-7范圍越遠(yuǎn),色譜柱性能下降的越快.

溫度:典型硅膠基質(zhì)色譜柱的使用溫度在5°與60°C之間,高溫使用會(huì)縮短柱壽命.

緩沖溶液:生物樣品分離通常要求使用緩沖溶液控制流動(dòng)相的pH值,仔細(xì)控制避免緩沖溶液與流動(dòng)相有機(jī)溶劑混合時(shí)產(chǎn)生沉淀,色譜柱和 HPLC系統(tǒng)不能儲(chǔ)存在含鹽或緩沖溶液的體系中.

:操作壓力升高,色譜柱壽命縮短,通常要求色譜柱使用中壓力低于3000 psi.壓力與流動(dòng)相流速和柱長(zhǎng)成正比,與粒徑平方成反比.相同規(guī)格的3 m 填料色譜柱壓力約為5 m色譜柱的兩倍.流動(dòng)相不同壓力也會(huì)有明顯差異,如60/40的甲醇/水大約是60/40甲醇/水的兩倍.隨色譜柱使用,壓力會(huì)緩慢增加,色譜柱壓力突然增加可能是色譜柱或連接管堵塞.

2.色譜柱的維護(hù)

使用在線過(guò)濾器和保護(hù)柱能夠有效避免微粒和雜質(zhì)在色譜柱頭的聚集,增加色譜柱壽命, 在進(jìn)樣閥和色譜柱之間依次安裝在線過(guò)濾器和保護(hù)柱的效果可以.

過(guò)濾:進(jìn)樣閥和色譜柱之間的在線過(guò)濾器能夠有效阻止來(lái)自流動(dòng)相,泵密封圈和樣品的微粒.在線過(guò)濾器篩板的孔徑小于色譜柱入口篩板孔徑時(shí)效果可以.在線過(guò)濾器常用孔徑為0.5 m,系統(tǒng)壓力升高時(shí)需要更換在線過(guò)濾器.

保護(hù)柱:保護(hù)柱實(shí)際上通常是比較短的分析柱,通過(guò)吸附可能污染分析柱的強(qiáng)保留雜質(zhì)達(dá)保護(hù)色譜柱的目的.保護(hù)柱的篩板與在線過(guò)濾器一樣可以阻擋微粒雜質(zhì).為了達(dá)到可以的保護(hù)效果同時(shí)避免導(dǎo)致色譜的改變,可以選用與分析柱相同或相似的填料填充保護(hù)柱(如C18分析柱用 C18保護(hù)柱).保護(hù)柱不要選用保留太強(qiáng)的填料,以免使保留整體增加.為了降低保護(hù)柱對(duì)分離的貢獻(xiàn),可以用比分析柱填料保留弱的填料填充,如用150 C18分析柱時(shí),可以選用比表面積較小的300 大孔 C18填充保護(hù)柱.分離明顯變差或反壓明顯升高時(shí)需要更換保護(hù)柱.

3.色譜柱的清洗

如果樣品中部分組分沒(méi)有被流動(dòng)相洗脫,它們就會(huì)逐漸在色譜柱中聚集,最后導(dǎo)致色譜柱性能變差,為了保證色譜柱重復(fù)性,延長(zhǎng)使用壽命,應(yīng)該周期性地對(duì)色譜柱進(jìn)行清洗而不能夠任其自然.如果色譜柱設(shè)計(jì)中可以反向使用,反壓太高時(shí),用低流速反向沖洗不會(huì)對(duì)填充良好的硅膠柱床造成損害,反向沖洗時(shí)不要接檢測(cè)器. 反向沖洗一般使用常用流速的1/2,用強(qiáng)洗脫溶劑沖洗10-20色譜柱體積.反相色譜一般使用極性有機(jī)溶劑如異丙醇含量較高的溶劑沖洗.用幾次循環(huán)從弱到強(qiáng)的梯度有時(shí)比用強(qiáng)洗脫能力流動(dòng)相等度沖洗效果更好,對(duì)疏水性蛋白質(zhì)吸附的反相色譜柱非常明顯. 如果上述過(guò)程清洗色譜柱的效果不夠理想,可以用非極性有機(jī)溶劑或低濃度表面活性劑清洗,二氯甲烷或氯仿對(duì)強(qiáng)疏水性或油性化合物的效果較好,表面活性劑如 0.5% SDS可以有效清除沉淀的蛋白質(zhì),改性劑,如5-8M的脲或鹽酸胍可以有限去除強(qiáng)吸附蛋白質(zhì).另外,用明顯高或低于使用流動(dòng)相pH值的稀緩沖溶液對(duì)部分不溶性沉淀有較好的作用.比較有效地清洗方法還取決于色譜柱和樣品的具體情況.

上述過(guò)程的主要目的是去除在使用流動(dòng)相條件下不能洗脫的化合物,另一個(gè)目的是對(duì)由于流動(dòng)相或部分化合物引起緩慢變性的色譜柱進(jìn)行更新.用有機(jī)溶劑沖洗色譜柱之前,應(yīng)該首先用水含量較高的混合溶液(如90/10 H2O/ACN)將緩沖溶液和添加劑置換沖洗,不要用純水.升高溫度能夠改進(jìn)清洗效果. 色譜柱頭的燒結(jié)篩板用于固定色譜柱床填料,只有在準(zhǔn)備修補(bǔ)色譜柱時(shí)才能打開(kāi),建議在打開(kāi)之前與大連依利特分析儀器有限公司技術(shù)人員聯(lián)系.

4.色譜柱的儲(chǔ)存

乙腈和水的混合溶劑是儲(chǔ)存反相色譜柱的理想溶劑,其中乙腈含量應(yīng)不低于10%,避免在TFA等酸性條件下儲(chǔ)存色譜柱,緩沖溶液和添加劑應(yīng)該從系統(tǒng)中沖洗干凈,以免由于溶劑揮發(fā)造成沉積,理想的儲(chǔ)存溶劑應(yīng)該抑制微生物的生長(zhǎng)并不能導(dǎo)致固定相的水解,因此不能在純水條件下儲(chǔ)存色譜柱.儲(chǔ)存溶劑可以能夠與使用流動(dòng)相互溶,10% 乙腈儲(chǔ)存色譜柱可以直接用幾乎所有的分析流動(dòng)相平衡,不會(huì)引起鹽沉淀. 雖然沒(méi)有確切的色譜柱干燥儲(chǔ)存對(duì)性能影響的證據(jù),但為防止溶劑揮發(fā),不銹鋼堵頭比塑料堵頭更好.用醇/水混合溶劑清洗和儲(chǔ)存色譜柱時(shí),注意由于粘度較大, 避免導(dǎo)致壓力太高.?