怎樣選擇色譜柱
? 現(xiàn)代高效液相色譜中，分離效果好壞的一個(gè)重要指標(biāo)是色譜填的選擇。但是色譜填料的選擇范圍很寬，因此，要做合適的選擇，必須對(duì)此有一定的認(rèn)識(shí)和了解。
一. 硅膠基質(zhì)填料
1·正相色譜
正相色譜用的固定相通常為硅膠(Silica)以及其他具有極性官能團(tuán)胺基團(tuán)，如(NH2，APS)和氰基團(tuán)(CN，CPS)的鍵合相填料。
? 由于硅膠表面的硅輕基(SiOH)或其他極性基團(tuán)極性較強(qiáng)，因此，分離的次序是依據(jù)樣品中各組份的極性大小，即極性較弱的組份最先被沖洗出色譜柱。
正相色譜使用的流動(dòng)相極性相對(duì)比固定相低，如:正己烷(Hexane)、氯仿(Choroform)、二氯甲烷 (Methylene Cloride)等。
2，反相色譜
反相色譜用的填料常是以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對(duì)較弱官能團(tuán)的鍵合相。
反相色譜所使用的流動(dòng)相極性較強(qiáng)，通常為水、緩沖掖與甲醇、乙情等的混合物。
樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)的組份最先被沖洗出，而極性弱的組份會(huì)在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。
常用的反相填料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H，(Phenyl)等。
二·聚合物填料
聚合物填料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸醋等，其主要優(yōu)點(diǎn)是在pH值為1一14均可使用。
相對(duì)于硅膠基質(zhì)的C18填料，這類(lèi)填料具有更強(qiáng)的疏水性;大孔的聚合物填料對(duì)蛋白質(zhì)等樣品的分離非常有效。
現(xiàn)有的聚合物填料的缺點(diǎn)是相對(duì)硅膠基質(zhì)填料，色譜柱柱效較低。
液相色譜中的許多問(wèn)題都能在譜圖上反映出來(lái)，其中有一些問(wèn)題可以通過(guò)改變?cè)O(shè)備參數(shù)得到解決；而其他的問(wèn)題必須通過(guò)修改操作程序來(lái)解決。對(duì)于色譜柱和流動(dòng)相的正確選擇是得到好的色譜圖的關(guān)鍵。而面對(duì)常常發(fā)現(xiàn)的HPLC譜圖異常的問(wèn)題，如何做到真正解決問(wèn)題，則需堅(jiān)持這幾個(gè)原則：一具體問(wèn)題具體對(duì)待原則：二先外設(shè)后內(nèi)部原則：三由簡(jiǎn)而繁原則：四單一處理到綜全處理原則。 一、拖尾峰 1、篩板阻塞:柱子兩頭的過(guò)濾篩板如果堵塞，樣品就會(huì)在篩板部分受阻而形成時(shí)間延遲，使得樣品在柱后流出時(shí)峰型形成拖尾。需要通過(guò)反沖色譜柱，或者更換篩板。 2、色譜柱塌陷:是指色譜柱由于其它原因引起了柱效率喪失，不能對(duì)物質(zhì)形成保留，使得物質(zhì)不在固定相上保留而隨流動(dòng)相流出，但是又還有一點(diǎn)柱效，因此形成拖尾。需要重新填充色譜柱或者更換色譜柱。 3、有污染:即樣品不在同一起跑線(xiàn)起跑，從后面開(kāi)始跑得到達(dá)終點(diǎn)稍晚，表現(xiàn)出拖尾。更換色譜柱或者采用有機(jī)溶劑梯度洗脫1h以上，以沖洗柱子。 4、流動(dòng)相PH值選擇錯(cuò)誤:如某PH下有的樣品存在分子型和離子型的動(dòng)態(tài)平衡，離子型的陸續(xù)向分子型轉(zhuǎn)化就會(huì)表現(xiàn)出拖尾。調(diào)節(jié)PH值可抑制分子解離，改善拖尾，對(duì)于堿性化合物，相對(duì)較低的PH值更有利于得到對(duì)稱(chēng)峰。 二、前沿峰 1、樣品過(guò)載:被保留的樣品在正常出峰時(shí)間前陸續(xù)出來(lái)，形成前沿峰。降低樣品含量。 2、樣品溶劑選擇不恰當(dāng):當(dāng)樣品溶劑的洗脫能力大大強(qiáng)于流動(dòng)相時(shí)會(huì)出現(xiàn)前沿峰，例如，在反相色譜中用已腈做樣品溶劑，而流動(dòng)相的洗脫力較弱時(shí)會(huì)出現(xiàn)前沿峰。選擇流動(dòng)相或者接近流動(dòng)相的比例作為樣品溶劑。 3、色譜柱損壞:色譜柱柱效損失，不能對(duì)物質(zhì)形成保留。更換色譜柱。 4、假象前沿峰:在大峰前有小峰出現(xiàn),假象前沿峰，即大峰前包埋了沒(méi)有分開(kāi)的小峰。調(diào)整流動(dòng)相洗脫梯度。 三、基線(xiàn)漂移 1、柱溫波動(dòng):即使是很小的溫度變化都會(huì)引起基線(xiàn)的波動(dòng)，通常影響示差檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器、較低靈敏度的紫外檢測(cè)器或其它光電類(lèi)檢測(cè)器。使用柱溫箱，控制好柱子和流動(dòng)相的溫度，在檢測(cè)器之前使用熱交換器。 2、流動(dòng)相不均勻:流動(dòng)相條件變化引起的基線(xiàn)漂移大于溫度導(dǎo)致的漂移。使用HPLC級(jí)的溶劑，流動(dòng)相在使用前進(jìn)行脫氣處理。 3、流通池被污染或有氣體:用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑沖洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸（不要用鹽酸）。 4、流動(dòng)相配比不當(dāng)或流速變化:更改配比或流速，為避免這個(gè)問(wèn)題可定期檢查流動(dòng)相組成及流速。 5、樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì):以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個(gè)逐步升高的基線(xiàn)。使用保護(hù)柱，如有必要，在進(jìn)樣之間或在分析過(guò)程中，定期用強(qiáng)溶劑沖洗柱子。 四、出現(xiàn)寬峰 1、塔板數(shù)降低:色譜柱污染或失效，造成塔板數(shù)降低。更換同樣類(lèi)型的色譜柱，如果新柱子可以提供對(duì)稱(chēng)的色譜峰，則用強(qiáng)溶劑沖洗舊柱子。 2、管路太長(zhǎng)或管路內(nèi)徑太大:柱子與檢測(cè)器之間的管路太長(zhǎng)或管路內(nèi)徑太大。更換內(nèi)徑較小的短管路。 3、檢測(cè)器響應(yīng)過(guò)大:檢測(cè)器對(duì)反應(yīng)時(shí)間或池體積響應(yīng)過(guò)大。減少響應(yīng)時(shí)間或使用更小的流通池。 五、基線(xiàn)噪音 1、尖銳峰:在流動(dòng)相、檢測(cè)器或泵中有空氣。流動(dòng)相脫氣，沖洗系統(tǒng)以除去檢測(cè)器或泵中的空氣。 2、漏液:檢查管路接頭是否松動(dòng)，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換泵密封。 3、流動(dòng)相混合不完全:用手搖動(dòng)使混合均勻或使用低粘度的溶劑。 4、溫度影響:柱溫過(guò)高，檢測(cè)器未加熱。使用柱溫箱，減少溫度差異或加上熱交換器。 5、偶然噪聲:在同一條線(xiàn)上有其他電子設(shè)備，斷開(kāi)LC、檢測(cè)器和記錄儀，檢查干擾是否來(lái)自于外部，加以更正。采用精密級(jí)穩(wěn)壓電源。 六、分離度不夠 1、流動(dòng)相梯度洗脫設(shè)置不合理:優(yōu)化梯度洗脫程序。 2、流動(dòng)相污染或變質(zhì):引起保留時(shí)間變化，重新配置流動(dòng)相。 3、保護(hù)柱或分析柱阻塞:去掉保護(hù)柱進(jìn)行分析，如果必要?jiǎng)t更換保護(hù)柱；如果分析柱阻塞，可進(jìn)行反沖；如果問(wèn)題仍然存在色譜柱可能被強(qiáng)保留的污染物損壞，建議使用恰當(dāng)?shù)脑偕绦颍蝗绻麊?wèn)題仍然存在，進(jìn)口可能阻塞了，更換入口處的篩板或更換色譜柱。 一.主要技術(shù)指標(biāo)優(yōu)異： 首先是如何看指標(biāo)。液相色譜儀的指標(biāo)很多，有泵的、的、等等。我們認(rèn)為要看主要技術(shù)指標(biāo)，根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，儀器的主要指標(biāo)有噪音，漂移，最小檢測(cè)濃度，定性定量重復(fù)性等。這些指標(biāo)都要放在系統(tǒng)，回路里去看，去比較。就是需要把各單元裝置都要聯(lián)接好，如接好色譜柱，進(jìn)樣閥，并且要通上流動(dòng)相。因?yàn)槟诜治鲋幸捕际锹?lián)接好以后才可以進(jìn)行分析的，而不是單單用個(gè)檢測(cè)器或是泵的。 然后在這個(gè)基礎(chǔ)上，我們?cè)偃ケ容^這些主要指標(biāo)。 1.噪音 噪音是指由儀器的電器元件、溫度波動(dòng)、電壓的線(xiàn)性脈沖以及其他非溶質(zhì)作用產(chǎn)生的高頻噪聲和基線(xiàn)的無(wú)規(guī)則波動(dòng)。噪音的大小直接關(guān)系到儀器的檢測(cè)靈敏度，噪音越大，檢測(cè)的靈敏度就越低。對(duì)于檢測(cè)低含量的樣品就要求儀器的噪音越小越好，否則噪音過(guò)大將會(huì)導(dǎo)致基線(xiàn)不穩(wěn)，甚至影響分析結(jié)果。 2.最小檢測(cè)濃度(最小檢測(cè)限) 最小檢測(cè)濃度是反映儀器靈敏度的重要參數(shù)。CL=2×Nd×C/H(CL ：最小檢測(cè)濃度 Nd:噪音C：樣品濃度最小檢測(cè)濃度H：樣品峰高)由上式可見(jiàn)，最小檢測(cè)濃度是和噪音成正比的，噪音越大，最小檢測(cè)濃度就越大，靈敏度就越低。某些廠家回避了這個(gè)指標(biāo)，說(shuō)明他們不愿在最小檢測(cè)濃度的基礎(chǔ)上去比較噪音。 3.漂移 漂移是指儀器穩(wěn)定后一段時(shí)間內(nèi)基線(xiàn)漂離**的距離，通常用來(lái)衡量?jī)x器穩(wěn)定快慢。高品質(zhì)的儀器能在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定，從而在一定程度上提高了分析效率。 4.定性定量重復(fù)性 定性定量重復(fù)性主要是考核儀器穩(wěn)定性的指標(biāo)，這對(duì)于分析樣品來(lái)說(shuō)是非常重要的。好的儀器其穩(wěn)定性應(yīng)該是十分優(yōu)秀的，這就要求多次進(jìn)樣保留時(shí)間及含量的一致性，這樣做出來(lái)的結(jié)果才能使人信服。 有的朋友會(huì)認(rèn)為這些指標(biāo)好像都是檢測(cè)器的。對(duì)的，但是就前面所說(shuō)條件是要放在整個(gè)回路和系統(tǒng)里去看去比較。例如：泵的脈動(dòng)會(huì)直接影響噪音指標(biāo)，泵的流量準(zhǔn)確度、精確度指標(biāo)，以及密封性不好也會(huì)影響相關(guān)指標(biāo)。所以要系統(tǒng)地看指標(biāo)。例如：某些公司在公布的指標(biāo)中，噪音和漂移指標(biāo)寫(xiě)的條件是空池或有的干脆不寫(xiě)。這個(gè)指標(biāo)只考核了UV檢測(cè)器光學(xué)和電氣的特性，與實(shí)際情況相差甚遠(yuǎn)，并沒(méi)有考驗(yàn)泵的壓力脈動(dòng)，液流回路的阻尼和UV檢測(cè)器流通池的性能。所以我們認(rèn)為從以上的主要指標(biāo)中可以反應(yīng)出儀器的一些真實(shí)水平。 二.操作方便： 操作方便性無(wú)論是對(duì)新手還是成熟的用戶(hù)都是很重要的。操作越簡(jiǎn)單，有利于提高分析效率，也為以后分析方法的拓展提供有力的幫助。 三.系統(tǒng)的，整體開(kāi)發(fā)： 這里指的是儀器的整體開(kāi)發(fā)，是一個(gè)完整的系統(tǒng)。目前市場(chǎng)上有這個(gè)現(xiàn)象，說(shuō)我的泵是進(jìn)口的，或者是檢測(cè)器怎么好，用了什么很多的進(jìn)口件組裝等等。其實(shí)這是個(gè)誤區(qū)。液相色譜儀是個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，不是整體開(kāi)發(fā)的，各項(xiàng)指標(biāo)之間、軟件和硬件、硬件和硬件等都不匹配，整體水平不會(huì)高到哪里去，而且在售后服務(wù)方面對(duì)用戶(hù)也是不負(fù)責(zé)任的。 整體開(kāi)發(fā)的主要優(yōu)點(diǎn)有：各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)統(tǒng)一、儀器各單元的通信協(xié)調(diào)、能夠建立一個(gè)整體的數(shù)字化評(píng)價(jià)系統(tǒng)、體現(xiàn)了企業(yè)的科技及開(kāi)發(fā)實(shí)力。 國(guó)外知名的儀器生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品也是整體開(kāi)發(fā)的，所以能夠保證儀器的整體水平。 四.穩(wěn)定可靠，故障率低。液相色譜圖異常的問(wèn)題、原因與解決方法
如何選擇一臺(tái)品質(zhì)優(yōu)良的液相色譜儀
北京市
449717568
ICP備案證書(shū)號(hào):京ICP備17017575號(hào)-1
